2021 Fiscal Year Annual Research Report

Elucidation of the role of endocycle in steroidogenesis

Research Project

Project/Area Number	21H02521
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	University of Shizuoka
Principal Investigator	大原裕也静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80771956)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	核内倍加 / DNA損傷応答経路 / エクジソン / 前胸腺 / H2Av / ATM
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、核内倍加を遂行するショウジョウバエ前胸腺を対象に、核内倍加依存的なDNA損傷応答経路によるエクジソン産生制御機構を明らかにすることを目的とした。2021年度は、核内倍加およびDNA損傷応答経路の下流で機能する遺伝子群を同定するために、核内倍加の開始に必須なfizzy-related（fzr）やDNA損傷応答経路の因子であるH2Av（Histone H2A variant）を阻害した前胸腺を対象に、RNAシーケンシングを試みたが、ライブラリ調整の段階で実験が難航している。また、本研究では、H2Avのリン酸化を制御することが知られているAtaxia telangiectasia mutated（ATM）が前胸腺においてどのような役割を担っているのかを明らかにするために、遺伝学的な解析を行った。その結果、ATM変異体では、H2Av変異体と同様に、エクジソンによって制御される幼虫から蛹への移行が大幅に遅延し、この表現型はエクジソン経口投与によりレスキューされた。さらに、前胸腺選択的なATMノックダウン個体においても、幼虫から蛹への移行が遅延した。これらの結果は、ATMはエクジソン産生を促進することを強く示唆しており、ATMは正常な蛹化に必須であることを示している。ATMはDNA二本鎖切断に応答してH2Avのリン酸化を引き起こすこと、核内倍加によってDNA二本鎖切断が引き起こされることから、前胸腺において核内倍加の進行に伴いDNA二本鎖切断が起こり、これに引き続きATM-H2Av経路とエクジソン産生が逐次的に活性化する可能性が考えられる。一方、DNA一本鎖切断に応答してH2Avをリン酸化するAtaxia Telangiectasia and Rad3 Related Protein（ATR）を前胸腺選択的にノックダウンした場合、発生過程に異常は見受けられず、ATR変異体においてもまた発育過程において表現型は観察されなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2021年度は、核内倍加およびDNA損傷応答経路の下流で機能する遺伝子群を同定するために、核内倍加やH2Avを阻害した前胸腺を対象に、RNAシーケンシングを試みたが、ライブラリの作製に関する条件検討が難航した。前胸腺は様々な組織に囲まれた微小な内分泌組織であり、解剖により十分な数の前胸腺を精度よく回収できなかったことが理由として挙げられる。また、前胸腺は比較的粘着性の高い組織であり、解剖器具等に付着しスムーズな回収・プールが妨げられたことも本実験が難航した理由の一つである。一方、前胸腺におけるH2Avの上流因子の解析については、おおむね順調に実験が進んでいる。上記の通り、遺伝学的解析の結果、H2Avのリン酸化を司ることが知られているATMが、前胸腺において蛹化に必須な役割を果たすことが明らかとなった。ATM変異体系統およびノックダウン系統を用いた表現型解析に着手するまでの準備（バランサー染色体の調整、交配に要する個体数の確保）を年度内に完了することができ、表現型解析を遂行することができた。
Strategy for Future Research Activity	2022年度は、核内倍加およびDNA損傷応答経路の下流遺伝子群の同定を実現するために、正常な前胸腺、ATMを阻害した前胸腺、fzr（核内倍加の開始に必須な因子）を阻害した前胸腺を対象に、組織の摘出・プール、ライブラリ調整、およびRNAシーケンシングを進めていく予定である。ライブラリー作成の際にはシングルセル用のライブラリ調整キットを用いることで、必要な組織量・RNA量を減らす。これに先立ち、ATMを阻害した前胸腺において核内倍加の進行が阻害されないか否かを組織染色により確認し、ATMの阻害が前胸腺の核内倍加を阻害する場合は、代わりにH2Avを阻害した前胸腺を対象として上記のシーケンシングを行う。RNAシーケンシングに成功した場合は、核内倍加およびATM依存的にオープンな構造をとるクロマチン領域を明らかにするために、ATAC-seqに向けたライブラリ調整を進める。さらに、前胸腺におけるATMの機能を更に明らかにするために、以下の遺伝学的解析を行う。ATM変異体やノックダウン個体においてエクジソン合成酵素の発現が低下しているか否か定量RT-PCRにより検証するとともに、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いてエクジソン濃度が低下しているか調べる。次に、ATM変異体およびノックダウン個体の前胸腺においてリン酸化H2Avのレベルが低下しているか否か免疫染色により確認し、ATM依存的なH2Avのリン酸化が認められた場合、ATM変異体およびノックダウン個体の表現型は活性型H2Avの強制発現によりレスキューされるか検証する。なお、このレスキュー実験に必要な活性型H2Av発現系統を作出する必要があり、H2Avのクローニング、活性化に必要な変異の導入、およびインジェクションによる遺伝子導入を進める。