2021 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular and cellular mechanisms of long-term memory maintenance
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21H02528
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
坂井 貴臣 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (50322730)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武尾 里美 東京都立大学, 理学研究科, 助教 (10642100)
上野 耕平 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳・神経科学研究分野, 副参事研究員 (40332556)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / 長期記憶 / 記憶維持 / CREB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「記憶」は動物が自然界で生存する上で必要不可欠な生命現象であり、脳における最も重要な機能の一つである。しかし、記憶はどのようにして脳で長期間維持され続けるのか、その分子機構の詳細はほとんど明らかになっていない。我々は近年、ショウジョウバエ（以下ハエ）が光を利用して長期記憶を維持しているという興味深い事実を見出した。さらに、ハエ記憶中枢（キノコ体）における転写因子CREBの活性化が記憶維持に必須であり、キノコ体のCREB転写活性も光依存的であることを見出した（Inami et al., 2020）。そこで本研究は、「光による長期記憶の維持」という現象を最大限に活用し、精度の高い遺伝子発現プロファイリングを通して「長期記憶の維持システム」を分子・細胞レベルで明らかにすることを目的とした。
精度の高い遺伝子発現プロファイリングを実現するには、記憶維持に利用されているニューロンのみからRNA抽出することが理想的である。ハエ記憶中枢には約4000個のニューロンが存在し、記憶中枢においてCREBが発現するニューロンは多数存在する。しかし、光によりCREB活性が上昇するニューロンはその一部である。本研究では、光によりCREB活性が上昇するニューロン、つまり記憶維持に機能している細胞のみを磁気ビーズを用いて回収する方法を確立し、それらのニューロンにおいて光依存的に発現が上昇する遺伝子を網羅的に探索することにした。現在、これらの実験系の実現に向けて、必要な形質転換系統をデザインし、複数の系統を作製している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画した形質転換バエのコンストラクトは以下の３つである：①6xCRE-FRT-stop-FRT-LexA系統、②MB-FLP系統、③LexAop-mCD8::GFP系統。①6xCRE-FRT-stop-FRT-LexA系統は、CREB活性を検出するためのコンストラクトである。CREBが活性化するとLexA::GADの発現を誘導しようとするが、転写終結配列（stop配列）により転写は起こらない。stop配列は2つのflippase recognition target（FRT）の配列の間に挟まれており、組み換え酵素であるFLPが発現する細胞ではFLPがFRT配列を認識し、FRT-stop-FRT配列を取り除く（図２B、FLP-out）。
②MB-FLP系統は、キノコ体（MB: mushroom body）で組み換え酵素であるFlippase（FLP）を発現するコンストラクトである。したがって、6xCRE-FRT-stop-FRT-LexA系統と組み合わせると、主にキノコ体でFLP-outが生じ、転写因子であるLexA::GADが発現する。①と②のハエに加えて③LexAop-mCD8::GFP系統を組み合わせると、LexA::GADによりmCD8::GFPが発現する。すなわち、CREBが活性化した細胞のみにmCD8::GFPが発現する。mCD8抗体を用いて記憶中枢ニューロンに磁性ナノビーズを付加し、磁石によりmCD8::GFP発現ニューロンのみを回収する予定である。
これまでに、MB-FLP系統を2系統（R13F02-FLPおよびR55D03-FLP）を作製し、それらの動作確認を行った。その結果、R13F02-FLP系統では主にキノコ体ニューロンでフリップアウトが生じることを確認した。一方、R55D03-FLP系統ではFLPの動作が確認できなかった。よって、本研究にはR13F02-FLP系統を利用することにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
6xCRE-FRT-stop-FRT-LexA系統に関しては、繰り返し配列が多く、予想以上にコンストラクト作製に時間がかかった。通常のクローニングでは作製が困難であったため、人工遺伝子合成により作製した配列をインジェクション用プラスミドに導入する方法に切り替えて作製する予定である。また、磁石による細胞回収の実験系を今後確立していく。
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