2022 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensively identification of molecules at synapses and non-synaptic cell-adhesion structure
| Project/Area Number |
21H02582
|
|---|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
高野 哲也 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 研究員 (00725541)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 綾 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, チームリーダー (40424171)
掛川 渉 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70383718)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | BioID / シナプス / 神経回路 / ドーパミン / 分子 / 小脳 / プルキンエ細胞 / プロテオーム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞はシナプスと呼ばれる細胞接着構造を形成することで、脳高次機能を担う様々な神経回路網を構築する。さらに、近年では神経細胞間や非神経細胞間にシナプスではない接着構造が存在し、複雑な脳内情報伝達を生み出していることもわかってきた。しかしながら、従来までの方法では特定のシナプス及び非シナプス性接着部位の構成分子を同定することが困難であった為、分子機序やその生理的意義については依然として不明のままであった。本研究では、近依存性ビオチン標識法を用いて、特定のシナプス及び非シナプス性接着構造を制御する構成分子群の網羅的探索を行い、個々の神経回路網や非シナプス性部位特異的な形成機構と生理的意義を解明することによって、全く新しい観点からの脳の動作原理及び精神・神経疾患の病態の解明を進める。
本年度までに、小脳皮質回路において興奮性シナプス(平行線維―プルキンエ細胞間)と抑制性シナプス(分子層抑制性介在神経細胞―プルキンエ細胞間)の構成分子を網羅的に同定するために、Split-TurboID法を用いた定量質量分析解析を行った。その結果、生体組織中から79種もの分子が同定された。さらに、データベースを用いた分子機能解析を行ったところ、これらの分子はシナプスに存在する細胞膜表面分子であることがわかった。以上の結果から、Split-TurboID法は組織中の特定のシナプス構成分子を包括的に解析できる有効な手法であることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、小脳皮質回路において興奮性シナプス(平行線維―プルキンエ細胞間)と抑制性シナプス(分子層抑制性介在神経細胞―プルキンエ細胞間)の構成分子を網羅的に同定するために、近位依存性ビオチン標識(Split-TurboID)法を用いた定量質量分析解析を行った。その結果、ヘテな細胞集団で構成される生体組織中から79種のシナプス間隙分子が有意に同定された。さらに、得られた候補分子についてGO Term解析や各種データベースを使用した分子解析を行ったところ、これらの分子の大多数が細胞膜に関連するシナプス分子であることが示唆された。これらの結果から、Split-TurboID法は脳内の特定のシナプス間隙の構成分子を網羅的に解析する有効な手法であることが示唆された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在までの進歩状況から、Split-TurboID法を用いて生体組織の特定のシナプス間隙構成分子をビオチン標識し、質量分析によってタンパク質成分を網羅的に解析できることが示唆された。そこで、次年度はSplit-TurboID法を用いてシナプス間隙だけでなく、非シナプス性細胞接着部位の細胞間隙分子を解析できるのか検討する。具体的には、Split-TurboID法を腹側被蓋野から側坐核へのドーパミン作動性神経細胞に適用し、生体内での非シナプス性接着部位における構成分子群の網羅的探索を行う。まず、Split-TurboIDのN-TurboIDとC-TurboIDを生体内のドーパミン作動性神経細胞に遺伝子導入する。遺伝子導入の３週間後にビオチン皮下投与を行い、非シナプス細胞接着部位においてビオチン標識が誘導されるのか検討する。その後、ビオチン標識された分子が既知の非シナプス細胞接着分子であるのか免疫共染色及び生化学的実験で評価する。最後に、定量的質量分析法を用いて非シナプス性接着部位の構成分子群を同定し、分子間ネットワークを構築する。
|
