2021 Fiscal Year Annual Research Report

Drug discovery for fragile X syndrome based on the small molecular ligands that form self-assembles on the CGG repeats

Research Project

Project/Area Number	21H02612
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Nagasaki International University
Principal Investigator	佐々木茂貴長崎国際大学, 薬学部, 教授 (10170672)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	塩田倫史熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (00374950)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	脆弱X症候群 / リピート病 / FMR1遺伝子 / CGGリピート / 転写活性化 / 翻訳活性化 / 低分子創薬
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、DNA中のCGGリピート配列に協奏的に自己集積する低分子を基盤に、リピート数増加に伴い発症する脆弱X症候群(FXS)に対する低分子創薬を目指す。FXSの原因遺伝子であるFMR1遺伝子にはCGGリピート領域があり、このリピート数が55以下では正常であるのに対し、200以上では遺伝子が転写されず、発症する。近年、CGGリピート領域のシトシン５位メチル化の阻害が、FMR1遺伝子転写を活性化し、症状を軽減させることがわかり、新しい創薬戦略として注目されている。本研究では我々が開発したCGGリピート配列に自己集積する低分子を基盤に、細胞内でリピート数402の疾患モデル細胞のFMR1遺伝子の転写を活性化、さらには、それによる翻訳の活性化を検証し、脆弱X症候群に対する新しい創薬を目指す。 2021年度は、FMR1遺伝子のCGGリピートが伸長したヒトX 染色体を微小核融合した細胞株を用いてCGGリピート作用薬のスクリーニングを行い、FMR1 mRNA発現を上昇させるGW283を同定した。FMR1 mRNA発現が全く認められない脆弱X症候群由来線維芽細胞においてDNA脱メチル化剤5-aza-2-deoxycytidineとGW283を混合処置することで、FMR1 mRNA発現を上昇させることができた。2022年度は、脆弱X症候群由来線維芽細胞でFMRPタンパク質発現解析を行う。さらに、2021年度は、CGGリピートで形成されるグアニン4本鎖に作用し、ヘアピン―ループ構造に変化させる新しい化合物（MR）を用いて細胞毒性試験および翻訳活性化能を調べた。2022年度は、引き続き翻訳活性化を検討する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の目的は、脆弱X症候群(FXS)の原因遺伝子であるFMR1遺伝子中にある膨大な繰り返しCGGリピートを標的にした低分子化合物を探索し、FMR1遺伝子がコードする脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の産生を促し、創薬に展開しようとするものである。まず、FMR1 mRNA発現が全く認められない脆弱X症候群由来線維芽細胞において、mRNA発現を活性かする低分子化合物の決定が重要である。この点では、DNA脱メチル化剤5-aza-2-deoxycytidineとの共存によって、高リピート配列選択的にmRNA発現を活性化する低分子GW283を見出したことは、重要な展開である。また、CGGリピートで形成されるグアニン4本鎖に作用し、ヘアピン―ループ構造に変化させる新しい化合物（MR）を用いて細胞毒性試験を行った。このように、CGGリピート配列に作用する低分子化合物の作用の一部を検証することができたことから、研究はほぼ順調に進行していると考えている。次のステップは創薬研究に展開するために、翻訳活性化を実現することに注力する。
Strategy for Future Research Activity	2021年度までに、膨大な繰り返しCGGリピート作用化合物を同定することができた。FMR1 mRNA活性化能を確認することができた化合物に関しては、脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の産生確認実験を行う。DNA脱メチル化剤5-aza-2-deoxycytidineの作用によってFMR1 mRNA産生は活性化されるが、それによるFMRPの産生量が少ないために定量的な検出が困難になっている。2022年度は併用する5-aza-2-deoxycytidineとGW283の多種の濃度条件における効果をウエスタンブロッティングによる特異的検出で検証する。グアニン4本鎖に作用し、ヘアピン―ループ構造に変化させる化合物（MR）については、GW283と同様にFMR1遺伝子への作用を検討する。