Establishment of a novel therapeutic strategy against influenza virus infection based on the regulation of cellular lipid metabolism.

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H02629
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Doshisha University
• Principal Investigator: 西川 喜代孝 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (40218128)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: インフルエンザ

Outline of Annual Research Achievements

１）DPPSの産生が抗ウイルス性amphisomeの形成に必須であることの証明
１－１）ABCA3高発現MDCK細胞ならびにPVF-tet処理した細胞を用い、IAV感染に対して産生誘導されるamphisomeを高純度に単離する系の確立を試みた。単離にあたっては、蛍光標識HAを発現するMDCK細胞を用い、PVF-tet処理後IAV感染させ、細胞をシリンジを用いてマイルドに破砕後、遠心処理によりamphisomeの粗画分を得た。この画分を抗LC3抗体で蛍光標識した。得られたamphisome画分をHAの蛍光並びにLC3の蛍光を指標に、FACSを用いてダブルポジティブ画分を分離後最終amphisomeとした。しかしながら、本法では蛍光を持たない脂質画分の持ち込みが多いことから、今後さらに純度を高める必要があることが示された。一方で、両細胞由来total lysateを用いて脂質抽出後、MS-MS分析装置を用いて各種脂質分子種分析を行った。その結果、感染に伴ってDPPS、DPPCの増加が再現性良く検出できる系を新たに確立した。
１－２）siRNAを用いたPS合成酵素（PSS1）のノックダウン、PSS1の高発現細胞の樹立（MDCK細胞あるいはヒト肺胞上皮細胞株A549を使用）を試みた。これまでに、PSS1のノックダウンの系を確立し、IAV感染に伴うamphisome形成ならびに細胞障害活性・ウイルス産生量に対する効果を検討した。その結果、PSS1のノックダウンによりamphisome の形成並びにPVF-tetの抗ウイルス活性が減弱すること、を見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ABCA3高発現MDCK細胞ならびにPVF-tet処理した細胞由来のtotal lysateを用いて、MS-MS分析装置を用いた各種脂質分子種分析系を確立したことは今後の進展にとって大きな進捗である。本評価系が確立できたことにより、誘導性amphisomeの調製の精度を確実に向上させることが可能となった。
また、siRNAを用いたPS合成酵素（PSS1）のノックダウンの系を確立できたことにより、PVF-tetのamphisome形成ならびに細胞障害活性・ウイルス産生量に対する抑制効果にPSS1が関与することを明確に示すことができた。

Strategy for Future Research Activity

誘導性amphisomeの調製については、今後density gradientを操作に組み入れることによって精度の向上を試みる予定である。さらに得られたamphisomeを用いて、脂質分析のみならず、タンパクの網羅的解析についても推進する。また、当初計画していたが推進が遅れている、LPCAT1、PSS1のノックダウンあるいは高発現による各autophagy関連分子の発現変動・活性化への影響についても検討を進める。本検討により、DPPSの詳細な作用点を解明できることが期待される。