Establishment of a novel therapeutic strategy against influenza virus infection based on the regulation of cellular lipid metabolism.

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H02629
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Doshisha University
• Principal Investigator: 西川 喜代孝 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (40218128)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: インフルエンザ / 誘導性アンフィソーム / 感染防御

Outline of Annual Research Achievements

DPPSの産生が抗ウイルス性amphisomeの形成に必須であることの証明
１）PVF-tet処理した細胞を用い、IAV感染に対して産生誘導されるamphisomeを高純度に単離する系の確立を試みた。蛍光標識HAを発現するMDCK細胞を用い、PVF-tet処理後IAV感染させ、細胞をシリンジを用いてマイルドに破砕後、遠心処理によりamphisomeの粗画分を得た。この画分を抗LC3抗体で蛍光標識し、HAの蛍光並びにLC3の蛍光を指標に、FACSを用いてダブルポジティブ画分を分離後最終amphisomeとした。しかしながら、本法では蛍光を持たない脂質画分の持ち込みが多いこと、LC3の蛍光が弱く分画精度に限界があることが判明したことから、密度勾配遠心を用いた分画を検討した。各種オルガネラマーカーを指標に分画条件を決定し、目的とするamphisomeがリソソームマーカーとよく一致すること、その他のオルガネラマーカーとはよく分離できることを見出した。この結果はamphisomeがオートファゴソーム経由で形成されるというこれまでの知見と合致している。現在スケールアップを試みており、その後のFACSによる最終生成に耐えられる画分の取得を目指している。
２）PSS1とLPCAT1の機能的連関の検討。DPPC形成に関わるLPCAT1を高発現させたA549細胞ではamphisomeの形成ならびに抗ウイルス活性が増強する。その一方で、PSS1をKOさせたA549細胞を用いた場合には、LPCAT1を高発現させてもamphisomeの形成ならびに抗ウイルス活性の増強が観察されなくなることを見出した。このことから、LPCAT1によって形成誘導されたDPPCがPSS1によってDPPSに変換されることが、抗ウイルス活性の発現に重要であることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今回、密度勾配遠心を用いたamphisome分画法を検討し、目的とするamphisome画分を精度高く分離できる条件を決定できた。このことは質量分析器（MS）を用いたamphisomeの性状解析を進めるにあたり大きな進捗である。また、DPPSの生成はLPCAT1によって形成誘導されたDPPCを介すること、すなわちDPPS合成に至る代謝経路を解明することができた。本知見は、ここで同定した代謝経路を制御できれば新たな創薬に結びつく可能性を示している。

Strategy for Future Research Activity

今回確立した手法を用いて誘導性amphisomeを調製し、MSを用いた脂質分析のみならず、タンパクの網羅的解析についても推進する。また、当初計画していたが推進が遅れている、１）LPCAT1、PSS1のノックダウンあるいは高発現による各autophagy関連分子の発現変動・活性化への影響、さらに２）PSS1 KOマウスを用いたIAV感染に対する感受性の検討、各種サイトカイン産生に及ぼす効果、についても検討を進める。本検討により、誘導性amphisome 形成の分子機構ならびに新たな感染制御法の確立につながることが期待される。