2022 Fiscal Year Annual Research Report
トリプレットリピート病のリピート長変動機構解明とリピート短縮治療の基盤確立
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21H02839
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
中森 雅之 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60630233)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | トリプレットリピート病 / DNA修復 / ハンチントン病 / 筋強直性ジストロフィー / リピート不安定性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
トリプレットリピート病は、３塩基繰り返し配列（リピート）の異常伸長が原因となる疾患の総称で、ハンチントン病など多くの神経難病が含まれる。これら疾患では、伸長したリピートが長いほど重症となるほか、リピート長は一定ではなく、変動することが知られている。トリプレットリピート病のリピート長変動には、伸長リピートが形成するslipped strand構造に対するDNA修復エラーが関与すると考えられているが、詳細なメカニズムは長らく解明されていない。われわれは、これまでの検討によりDNA修復蛋白によるslipped strand DNA切断を調整してリピート長変動を起こすことを見出しており、DNA修復蛋白の標的DNA結合性、slipped strand構造修復に影響を及ぼす一塩基多型を特定している。今年度は各多型での多量体形成能をWestern Blot法で判定した。さらに、人工的に修復基質となるslipped strand DNAをプラスミド上に形成させ、フットプリント法によりヌクレアーゼ活性と切断部位を明らかにすることで、リピート長短縮に重要なslipped strand DNA切断について、その部位や基質となる構造を解明した。
また、トリプレットリピート病患者では、大脳や骨格筋でリピートが長く、小脳では短いことが知られている。各組織でリピート長が異なる要因を同定するため、これら各組織の細胞系統単位でのリピート長およびその不安定性を、次世代シークエンサーを用いたロングリードシークエンシングを用いて解析した。また、RNA-seqによる網羅的発現解析により、各細胞系統でリピート長変動に影響をおよぼす遺伝子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNA修復蛋白の各一塩基多型での多量体形成能について予定どおり検証を完了した。また、ヌクレアーゼ活性評価実験にもちいる修復基質発現プラスミドの不具合はあったが、修復基質発現プラスミド再構築後、ヌクレアーゼ活性と切断部位の検証も完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA修復蛋白の一塩基多型によるDNA修復機構への影響について、DNA修復蛋白のCAG/CTG slip-out DNA へのexonucleaseとしてのcleavage siteとpausing site、およびendonucleaseとしてのcleavage siteとpausing siteを同定する。さらにリピート不安定性に影響をおよぼすとされるCAA interruptionに対するDNA修復蛋白のexonuclease活性、endonuclease活性を検証する。
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