2021 Fiscal Year Annual Research Report
Clarification of the mechanism of multistep leukemogenesis of acute megakaryoblastic leukemia associated with Down syndrome and development of the molecular targeted therapy
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21H02877
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
伊藤 悦朗 弘前大学, 医学研究科, 特任教授 (20168339)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土岐 力 弘前大学, 医学研究科, 講師 (50195731)
照井 君典 弘前大学, 医学研究科, 教授 (00333740)
工藤 耕 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (20455728)
金崎 里香 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60722882)
佐藤 知彦 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (70587005)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ダウン症候群 / 急性巨核芽球性白血病 / GATA1 / MYC / 分子標的療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ダウン症新生児の約10%にTAMと呼ばれる前白血病が発症し、その約20%は急性巨核芽球性白血病 (DS-AMKL)に進展する。我々は、DS-AMKLの新規原因遺伝子を10種類以上見出した。本研究では、新規遺伝子変異の機能解析とその結果に基づく治療法の開発を異なる３つのシステム（DS-AMKL細胞株、遺伝子改変マウス、ゼノグラフトモデル）を用いて行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、治療法の開発のために様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。令和３年度は以下の解析を行った。
1. X遺伝子の機能解析：DS-AMKLで高頻度に検出されたX変異の機能解析のために、ノックイン（KI) マウスを作製した。フローサイトメトリー法を用いて造血幹細胞・前駆細胞数を解析し、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行った。その結果、X-PTDは部分的な機能喪失変異であり、X-PTD KIマウスではリンパ球系及び骨髄球系造血が障害されていることが明らかになった。X-PTD KIマウスとGATA1sのみを発現するGATA1sマウスとの交配実験を行い経過観察したところ、骨髄異形症候群や白血病が発症した。
2. N遺伝子の機能解析：野生型Nを発現誘導可能なDS-AMKL細胞株を樹立した。RNAシークエンスで野生型NFIAにより誘導される遺伝子を網羅的に解析し、GSEAなどでパスウェイ解析を行った。その結果、遺伝子変異によりMYC/E2F経路の抑制が障害されることが明らかになった。
3. MYCを標的とした新規治療法の開発：DS-AMKL患者検体を用いて、BRD4インヒビターの感受性試験をin vitroで行う予定であった。しかし、芽球頻度が高く、細胞数が十分である解析可能な検体が今年度は入手できなかったため、実施できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の目的は、画期的な新規治療法を開発するためにDS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明することである。本年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
1. 我々が作製したX-PTDノックイン（KI) マウスは、白血球減少と血小板減少を認め、高率に白血病（T-ALL）を発症した。白血病発症の仕組みを解明するために、フローサイトメトリー法を用いて造血幹細胞・前駆細胞数を解析した。その結果、造血幹細胞、リンパ球共通前駆細胞などが減少しており、骨髄球系およびリンパ球系造血の両者が障害されていることが明らかになった。次に、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行った。その結果、X-PTD KIマウスの幹細胞は、遺伝子発現パターンとオープンクロマチン領域がX遺伝子のノックアウトマウスと類似しており、X-PTDは機能喪失変異であることが示唆された。X-PTD KIマウスとGATA1sのみを発現するGATA1sマウスとの交配したところ、骨髄異形症候群（MDS）や白血病が発症し、DS-AMKLのモデルマウス作成が前進した。
2. N遺伝子の機能解析の結果、既に解析を終えているI遺伝子及びZ遺伝子と同様に、N遺伝子もMYC自身を含めたMYC/E2F経路を抑制することにより、がん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。MYCのスーパーエンハンサーを抑制してMYCの発現を抑制するBRD4阻害剤は、これらの遺伝子が変異している４つのDS-AMKL細胞株にいずれも感受性が高い。本年度の解析結果により、BRD4阻害剤がDS-AMKLの新たな分子標的薬剤の有力な候補となることが裏付けられた。
3. MYCを標的とした新規治療法の開発：DS-AMKL患者検体を用いて、BRD4インヒビターの感受性試験をin vitroで行う予定であったが、検体入手が難しく、実施できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、昨年度の研究成果をもとに、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を継続し、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。
1. X-PTD KIマウスとGATA1sマウスとの交配実験を行い、AMKL発症の有無を観察する。初年度の解析でMDSあるいは白血病の発症が認められた。フローサイトメトリー法で腫瘍細胞の表面マーカーを解析し、白血病のサブタイプを解析する。さらに、発症前の骨髄あるいは脾臓細胞を用いてフローサイトメトリー法で造血幹細胞・前駆細胞数を解析し、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行う。さらに、腫瘍細胞のエクソーム解析を行い、付加的遺伝子異常を解析する。
2. 初年度の解析で、N遺伝子もMYCパスウェイを抑制することが確認されたため、N遺伝子によるMYCパスウェイ の抑制メカニズムについても解析を行う。なお、 I遺伝子については、その結合配列も明らかではなく、予備実験でもChIP-seqに使用できる抗I抗体はコマーシャルベースではなかった。このため、FLAGタッグを結合したI発現ベクターを構築し、DS-AMKL細胞株に発現させ、抗F抗体でChIP-seqを行う。平行して、抗IRX1ポリクロナール抗体を作製し、ChIP-seq用の抗体を確保する。
3. 我々は、MYCシグナリング経路がI、ZおよびN変異で共通に障害されることを見出した。MYC経路の下流にはサイクリンD・CDK4/6・RB1経路が存在することから、BRD4インヒビターの感受性試験に加え、実際に臨床で使用可能なCDK4/6インヒビター (Palbociclib) のDS-AMKL細胞株に対する感受性試験を行う。
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[Journal Article] Dyserythropoietic anaemia with an intronic GATA1 splicing mutation in patients suspected to have Diamond-Blackfananaemia.2022
Author(s)
Kobayashi A, Ohtaka R, Toki T, Hara J, Muramatsu H,Kanezaki R, Takahashi Y, Sato T, Kamio T, Kudo K, Sasaki S, Yoshida T, Utsugisawa T, Kanno H, Yoshida K, Nannya Y, Takahashi Y, Kojima S, Miyano S, Ogawa S, Terui K, Ito E
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Journal Title
eJHaem
Volume: 3
Pages: 163-167
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Post-induction MRD by FCM and GATA1-PCR are significant prognostic factors for myeloid leukemia of Down syndrome2021
Author(s)
Taga T, Tanaka S, Hasegawa D, Terui K, Toki T, Iwamoto S, Hiramatsu H, Miyamura T, Hashii Y, Moritake H, Nakayama H, Takahashi H, Shimada A, Taki T, Ito E, Hama A, Ito M, Koh K, Hasegawa D, Saito AM, Adachi S, Tomizawa D
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Journal Title
Leukemia
Volume: 35
Pages: 2508-2516
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Predictive factors for the development of leukemia in patients with transient abnormal myelopoiesis and Down syndrome2021
Author(s)
Yamato G, Deguchi T, Terui K, Toki T, Watanabe T, Imaizumi T, Hama A, Iwamoto S, Hasegawa D, Ueda T, Yokosuka T, Tanaka S, Yanagisawa R, Koh K, Saito AM, Horibe K, Hayashi Y, Adachi S, Mizutani S, Taga T, Ito E, Watanabe K, Muramatsu H
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Journal Title
Leukemia
Volume: 35
Pages: 1480-1484
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Association of Multiple Gene Polymorphisms Including Homozygous NUDT15 R139C With Thiopurine Intolerance During the Treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia2021
Author(s)
Kudo K, Sato T, Takahashi Y, Yuzawa K, Kobayashi A, Kamio T, Sasaki S, Shimada J, Otani K, Tusjimoto S, Kato M, Toki T, Terui K, Ito E
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Journal Title
J Pediatr Hematol Oncol
Volume: 43
Pages: e1173-e1176
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Usefulness of functional splicing analysis to confirm precise disease pathogenesis in Diamond-Blackfan anemia caused by intronic variants in RPS192021
Author(s)
Takafuji S, Mori T, Nishimura N, Yamamoto N, Uemura S, Nozu K, Terui K, Toki T, Ito E, Muramatsu H, Takahashi Y, Matsuo M, Yamamura T, Iijima K
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Journal Title
Pediatr Hematol Oncol
Volume: 38
Pages: 515-527
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Analysis of disease model iPSCs derived from patients with a novel Fanconi anemia-like IBMFS ADH5/ALDH2 deficiency2021
Author(s)
Mu A, Hira A, Niwa A, Osawa M, Yoshida K, Mori M, Okamoto Y, Inoue K, Kondo K, Kanemaki MT, Matsuda T, Ito E, Kojima S, Nakahata T, Ogawa S, Tanaka K, Matsuo K, Saito MK, Takata M
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Journal Title
Blood
Volume: 137
Pages: 2021-2032
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Reduced-intensity conditioning is effective for hematopoietic stem cell transplantation in young pediatric patients with Diamond-Blackfan anemia2021
Author(s)
Koyamaishi S, Kamio T, Kobayashi A, Sato T, Kudo K, Sasaki S, Kanezaki R, Hasegawa D, Muramatsu H, Takahashi Y, Terui K, Ito E, et al.
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Journal Title
Bone Marrow Transplant
Volume: 56
Pages: 1013-1020
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] An international retrospective study for tolerability of 6-mercaptopurine on NUDT15 bi-allelic variants in children with acute lymphoblastic leukemia2021
Author(s)
Tanaka Y, Yeoh AEJ, Moriyama T, Li CK, Kudo K, Arakawa Y, Buaboonnam J, Zhang H, Liu HC, Ariffin H, Chen Z, Kham SKY, Nishii R, Hasegawa D, Fujimura J, Keino D, Kondoh K, Sato A, Ueda T, Yamamoto M, Taneyama Y, Hino M, Takagi M, Ohara A, Ito E, Koh K, Hori H, Manabe A, Yang JJ, Kato M
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Journal Title
Haematologica
Volume: 106
Pages: 2026-2029
DOI
Peer Reviewed
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