Therapeutic applications by using long non-coding RNA-mediated gene expression regulation

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H03034
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 関亦 正幸 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (80250190)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 関亦 明子 福島県立医科大学, 看護学部, 教授 (50321823) ; 伊関 憲 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70332921)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: サイトカイン / インターロイキン９ / サイレンサー / 染色体構造 / 遺伝子発現 / 炎症制御 / 長鎖非コードRNA / 全身性炎症反応症候群

Outline of Annual Research Achievements

敗血症などの全身性炎症反応症候群は、過剰なサイトカイン産生で重症化する致死性の高い疾患である。しかし、どのような機構で免疫系が過剰な反応を示し、大量のサイトカインを一気に放出するのか詳細についてはよく分かっていない。従ってサイトカインの過剰発現を抑制するための有効な治療法が確立していないのが現状である。本研究では、サイトカイン産生を適正に保つために、タンパク質の遺伝情報を持たない長鎖非コードRNA（lncRNA：long noncoding RNA）に着目し、このlncRNAによる遺伝子発現調節機能を利用した新たな炎症制御法の創成を目指している。そこで、気管支喘息重症化の原因サイトカインに一つであるインターロイキン９（IL-9）に着目した。申請者らはこれまでの研究で、IL-9遺伝子の下流6 kbの非コード染色体DNA領域にサイレンサーを同定し、このサイレンサーはIL-9遺伝子プロモーターに作用して転写を抑制できることを見出した。しかも、このサイレンサーからはタンパク質情報をコードしないlncRNAが転写されていることを、世界に先駆け突き止めた。IL-9遺伝子本体から遠位にあるIL-9サイレンサーが持つ転写抑制機能を、このlncRNAが担っている可能性が示唆された。そこでlncRNAの実体を解明するため、ゲノムDNA上のどの領域からlncRNA が転写されるのか正確な転写開始点と転写終結点を決定した。更に、このlncRNAに結合するタンパク質を網羅的に同定し、lncRNA複合体によるIL-9転写抑制のメカニズムの解明を進めた。さらに、lncRNAを欠損したマウスをゲノム編集技術で作製し、免疫制御におけるlncRNAの機能解明を進めている。以上の結果をもとに、現在、lncRNAによるIL-9遺伝子発現調節機能を利用した新たな炎症制御法の創成を推進している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

サイトカイン産生するヘルパー免疫Th細胞は、様々なサブセットに分化し特異的なサイトカインを産生することでその機能を発揮している。例えば、タイプ１ヘルパー免疫細胞（Th1）は、サイトカインとしてインターフェロンガンマ（IFN-g）を産生することでマクロファージや好中球を活性化して細胞性免疫反応に関与している。また、最近同定されたタイプ９細胞（Th9）の詳細な機能については不明な点が多いが、IL-9を過剰に産生することで気管支喘息の重篤化に関わることが知られている。これらのThサブセットは、特異的に産生するサイトカインで他のサブセットへの分化を抑制していることから、IL-9の転写量を、各サブセットを用いたRT-PCR法で解析したところ、Th1細胞において強いIL-9の転写抑制が認められた。おそらく、この転写抑制されているTh1細胞において、IL-9サイレンサーが機能していると推測された。そこで、このサイレンサー領域から転写されるlncRNAの転写開始点と終結点をRACE法で解析したところ、全長約500 bpの２つのlncRNAがセンス・アンチセンスの両鎖から互いにhead-headで転写されていることが判明した。これら２つのlncRNAはイントロンを含んでいなかった。さらに、これらのlncRNAに結合するタンパク質をLC-MS/MSの質量分析法で解析したところ、転写抑制に関係する一連のRNA結合タンパク質が同定できた。次に、IL-9サイレンサーを欠損したゲノム編集マウスを作製し解析したところ、この欠損マウスではIL-9の発現上昇が観察された。以上の解析から、IL-9サイレンサーから転写されるlncRNA はタンパク質と結合した複合体として転写抑制に関与していることが示唆さたれ。

Strategy for Future Research Activity

これまでの解析で、IL-9サイレンサーから転写されるlncRNAの実体が徐々に明らかになってきた。すなわち、lncRNAは特異的結合タンパク質と複合体を形成し、転写抑制に関与していることが判明した。さらに、lncRNAを含むIL-9サイレンサー領域欠損マウスを用いた解析でも、IL-9サイレンサーはIL-9の転写抑制に関与していることがマウス個体レベルでも判明した。今後は、この欠損マウスを用いて炎症制御における機能の解明を進める。そのため、抗原特異的に炎症誘導できる肺炎誘導実験や肺炎球菌による感染実験を実施して、炎症制御における本lncRNAの機能をマウス個体レベルで解明する。次に、IL-9サイレンサー内に存在すると思われるIL-9サイレンサー特異的なプロモーターを決定する。この同定したプロモーターを組み込んだルシフェラーゼ活性をレポーターとして用いる転写活性測定用のレポーターベクターに組み込んで、各Thサブセット細胞を用いたトランスフェクション測定を行うことで、どの領域に転写活性開始点であるプロモーター活性化あるか決定する。これにより、lncRNAの転写がそのように制御されているか解明する。更に、本lncRNAを過剰発現したレポーター細胞株を用いて、lncRNAの活性を増強、または、抑制する低分子化合物の創薬ライブラリーからのスクリーニングを進める。これにより、得られる化合物を活用した新たな炎症制御法の創成を目指す。