2021 Fiscal Year Annual Research Report

PI3K/Akt腱再生シグナルの解明による新規腱再生治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	21H03052
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Gifu University
Principal Investigator	河村真吾岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (30456511)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平川明弘岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (50422720) 秋山治彦岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60402830)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	腱損傷 / PI3K/Aktシグナル / 再生医療
Outline of Annual Research Achievements	①腱再生におけるPI3K/Aktシグナルのin vivo機能解析の追加 Scx-CreERT2/Ptenflox/flox (gain of function)マウス、Scx-CreERT2/Rosa26-loxP-stop-loxP-Pten (loss of function)マウスにタモキシフェンを投与後、腱断裂モデルを作製した。腱損傷1ヶ月後の再生腱を組織学的に解析し、PI3K/Aktシグナル活性化による腱再生促進効果（intrinsic healingの改善）を確認した。その際にScx陽性細胞以外の細胞群による腱再生（extrinsic healing）も多数見られることが明らかとなった。そのため、Tppp3-CreERT2/Ptenflox/flox (gain of function)マウス、Tppp3-CreERT2/Rosa26-loxP-stop-loxP-Pten (loss offunction)マウスを作製した。 ②PI3K/Aktシグナルの上流制御機構の解析 RNAシークエンス解析でみられたPI3K/Aktシグナルの上流制御機構として細胞外マトリックス構成タンパクの変化に着目した。若齢マウス腱損傷時に高発現する遺伝子としてTnc,Thbs2を同定した。Tnc-HA、Thbs2-HAをクローニングしてpCAGベクターを作製し、HAタグ付きタンパクを合成、精製した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason in vivoにおいて、PI3K/Aktシグナルが腱再生に正に関与していることが証明できたため、本シグナルの上流制御機構について、候補遺伝子がpick-upし、解析に着手できたため。
Strategy for Future Research Activity	①腱再生におけるPI3K/Aktシグナルのin vivo機能解析作製したTppp3-CreERT2/Ptenflox/flox (gain of function)マウス、Tppp3-CreERT2/Rosa26-loxP-stop-loxP-Pten (loss offunction)マウスにおいて、Scx-CreERT2マウスと同様の実験（組織解析、再生腱からRNA、タンパクを抽出し、realtime PCR法、Western blot法(腱マーカー：Scx, Mkx, Tnmd,Dcn等、瘢痕マーカー：αSMA、Myh11, Tagln等)を用いて分子レベルでの腱再生効果を評価する。また、電子顕微鏡解析(コラーゲン径、配向性)、組織強度試験を行う。 ②PI3K/Aktシグナルの上流制御機構の解析候補タンパク質を腱細胞に添加し、PI3K/Aktシグナル活性化を誘導できるものを同定する。さらに、マイクロRNAシークエンスを行い、若齢マウス特異的（または高齢マウス特異的）miRNAを同定する。