Comprehensive understanding of the enhancer cluster regulating the expression of Indian hedgehog in the skeletal system

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H03142
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大庭 伸介 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20466733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983) ; 松尾 友紀 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (40792601) ; 北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80788422)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 骨格系 / インディアンヘッジホッグ / エンハンサー

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに取得した、Ihh遺伝子の上流およそ80 kbにわたって存在する5つのエンハンサー候補領域（エンハンサーA～E）について生理的・病的状態におけるエンハンサー活性の検証を行った。
（1）各エンハンサーによってルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導されるレポーターコンストラクトを作製し、マウス初代軟骨細胞やマウス・ヒト軟骨系細胞株（ATDC5、SW1353）に導入してレポーター発現を指標にエンハンサー活性を検討した。その結果、複数の領域についてエンハンサー活性を確認した。いくつかの領域については、タンデムコンストラクトにおいてコピー数依存性に活性の上昇を認めた。
（2）各エンハンサーによってlacZ遺伝子の発現が誘導されるレポーターを導入したトランスジェニックマウスを作出した。X-gal染色によってレポーター発現を検出し、エンハンサー活性とその組織特異性を検討した。その結果、エンハンサーAおよびCで骨組織特異的な活性を認めた。エンハンサーAは骨発生過程の中期より活性を示し、長管骨におけるその活性化領域はIhh mRNA発現領域とほぼ一致していた。一方、エンハンサーCは骨発生過程の初期に活性を示した。エンハンサーAとエンハンサーCについてはレポータートランスジェニックマウスをライン化し、次項の解析に用いた。
（3）エンハンサーAを中心に、レポータートランスジェニックマウスの病態モデルにおける活性を検討した。その結果、エンハンサーAのレポータートランスジェニックマウスを用いて変形性膝関節症モデルを作製すると、軟骨組織の変性に一致してエンハンサー活性を認めることが明らかとなった。その他の病態モデル、およびエンハンサーCのレポータートランスジェニックマウスについては検討が進行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画通りに、前年度までに取得したエンハンサー候補領域のエンハンサー活性をin vitroおよびin vivoの生理的状態・病態モデルにおいて検証できたため。

Strategy for Future Research Activity

エンハンサー候補領域の生物学的意義、活性化機構、活性調節因子の探索について、当初計画に沿って研究を遂行する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 南カリフォルニア大学/コネチカット大学(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: 南カリフォルニア大学/コネチカット大学
• [Journal Article] Runx2 regulates chromatin accessibility to direct the osteoblast program at neonatal stages. (2022)
  • Author(s): Hojo H, Saito T, He X, Guo Q, Onodera S, Azuma T, Koebis M, Nakao K, Aiba A, Seki M, Suzuki Y, Okada H, Tanaka S, Chung UI, McMahon AP, Ohba S
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 40 Pages: 111315
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111315
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Sp7 action in the skeleton: its mode of action, functions, and relevance to skeletal diseases. (2022)
  • Author(s): Hojo H, Ohba S
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 23 Pages: 5647
  • DOI: 10.3390/ijms23105647
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single-cell RNA sequencing unravels heterogeneity of skeletal progenitors and cell-cell interactions underlying the bone repair process. (2022)
  • Author(s): Nakayama M, Okada H, Seki M, Suzuki Y, Chung UI, Ohba S, Hojo H
  • Journal Title: Regenerative Therapy Volume: 21 Pages: 9-8
  • DOI: 10.1016/j.reth.2022.05.001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Identifying gene regulatory networks in human skeletal development using human pluripotent stem cells and single cell analysis. (2023)
  • Author(s): Hojo H, Tani S, Okada H, Chung UI, Ohba S
  • Organizer: Human Development-from Embryos to Stem Cell Models-Cold Spring Harbor Asia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 転写因子Runx2を中心とした骨発生エンハンサーネットワークの解明. (2022)
  • Author(s): 北條宏徳, 齋藤琢, 小野寺晶子, 東俊文, 関真秀, 鈴木穣, 饗場篤, 鄭雄一, 大庭伸介
  • Organizer: NGS Expo 2022
• [Presentation] 1細胞多層解析を用いたヒト骨発生における遺伝子制御ネットワークの解明. (2022)
  • Author(s): 谷彰一郎, 岡田寛之, 齋藤琢, 田中栄, 鄭雄一, 北條宏徳, 大庭伸介
  • Organizer: 第40回日本骨代謝学会学術集会
• [Presentation] ヒト多能性幹細胞由来の3次元骨組織誘導とシングルセル・マルチオーム解析を用いたヒト骨形成機構の解明. (2022)
  • Author(s): 谷彰一郎, 岡田寛之, 関真秀, 鈴木穣, 斎藤琢, 田中栄, 鄭雄一, 北條宏徳, 大庭伸介：ヒト多能性幹細胞由来の3次元骨組織誘導とシングルセル・マルチオーム解析を用いたヒト骨形成機構の解明.
  • Organizer: 第95回日本整形外科学会学術集会
• [Presentation] Elucidating gene regulatory networks underlying human skeletal development by integrating a model of human endochondral bones and single-cell multiomics. (2022)
  • Author(s): Tani S, Okada H, Seki M, Suzuki Y, Saito T, Tanaka S, Chung UI, Hojo H, Ohba S
  • Organizer: 2022 Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Elucidating gene regulatory meshanisms underlying human skeletal development by integrating single-cell dynamics of chromatin accessibility and gene expression. (2022)
  • Author(s): Tani S, Okada H, Seki M, Suzuki Y, Saito T, Tanaka S, Chung UI, Hojo H, Ohba S
  • Organizer: International Society for Stem Cell Research 2022 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Elucidating gene regulatory meshanisms underlying human skeletal development using human plurioitent stem cell-derived bone tissues and single-cell multiome analysis. (2022)
  • Author(s): Tani S, Okada H, Seki M, Suzuki Y, Saito T, Tanaka S, Chung UI, Hojo H, Ohba S
  • Organizer: ECTS (European Calcified Tissue Society) 2022 Congress
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 大阪大学大学院歯学研究科 組織・発生生物学講座
  • URL: https://web.dent.osaka-u.ac.jp/oa1/index.html