2022 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内コレステロールを基軸とした炎症慢性化の基盤的研究
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21H03366
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
早川 清雄 日本医科大学, 医学部, 講師 (00368292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 篤志 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80631150)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 炎症 / マクロファージ / 自然免疫 / コレステロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂質は、効率のよいエネルギー源となるのみならず、ホルモンや細胞膜の材料として必須な因子であると同時に、その代謝異常(脂質異常症)は動脈硬化症・糖尿病・慢性腎臓病などの疾患と密接に関わっていることが明らかとなっている。そこで本課題では、病態の発症や進展と密接に関連するマクロファージに着目し、細胞内コレステロールが、TLRs-Myd88経路を介する炎症反応をダイレクトに制御(活性化)するメカニズムの解明を目指している。細胞内に蓄積するコレステロールを、慢性炎症の新たな調節因子と位置づけ、細胞内コレステロールを軸とした炎症誘導メカニズムを理解し、マクロファージの細胞内コレステロールを標的とした動脈硬化治療や予防につなげる基盤的研究を進めた。これまでの解析結果から、炎症応答の増強には、急速な細胞内コレステロールの蓄積が関与していることが明らかとなった。そこで、炎症応答のシグナルがどのような経路で活性化されるのか、免疫沈降法およびウェスタンブロッティングで解析したところ、炎症シグナルの細胞内アダプター分子であるMyd88のオリゴマー形成にコレステロールが関与していることがわかってきた。実際、異なるタグを付加したMyd88を用いた解析において、ポリロタキサンで処理した細胞では、Myd88のオリゴマー形成が抑制された。Myd88欠損マウスを用いた動脈硬化形成と炎症応答に関する報告からも（Nature Med, 2004）、Myd88を中心としたコレステロールが関わる炎症応答の制御機構が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、細胞内コレステロールを炎症応答の調節因子と位置づけ、その基盤的研究を進めている。これまでの解析から、炎症応答と細胞内コレステロールの関係性が明らかになりつつあり、分子間の会合性に関する解析からコレステロール-Myd88を介した炎症応答の増強という予想された結果が得られつつある。現在、Myd88の関与を免疫沈降法やリコンビナントタンパク質を用いて詳細な解析を行い、またモデル動物を用いた解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの解析結果から、炎症誘導に伴い細胞内にコレステロールが急速に蓄積されることがGC-MS解析等により明らかになってきた。また、 細胞内小器官におけるコレステロール量が変化することも、共焦点レーザー顕微鏡を用いたイメージング解析でわかってきた。さらに、細胞内コレステロールの排泄を促進する薬剤として供与いただいたポリロタキサン(PRX)は、マクロファージ用いたGC-MS解析の結果から細胞内コレステロールを有意に減少させ、qPCRおよびELISA解析から炎症性サイトカインのmRNA発現およびタンパク質産生も有意に抑制することが明らかとなった。そこで本年度は、コレステロールが関与する細胞内のシグナル経路（TLRs-Myd88経路）を明らかにすることを目指し解析を行う。自然免疫応答が関わる受容体(TLRs)や調節因子をsiRNAでノックダウンまたは過剰発現させ、コレステロールの蓄積と炎症応答の関連性を、qRT-PCR法や蛍光細胞染色を行い、細胞の活性化や細胞内分子の局在変化を指標に解析を進める。さらに、炎症誘導性Ligands を用いて細胞を刺激し、どのようにコレステロールが関与するのかqRT-PCRやELISA法、さらにウェスタンブロッティング法を用いて検討する。本年度は、次世代シーケンサーを用いた細胞解析を行い、動物モデルにおいても炎症応答への細胞内コレステロールの関与を明らかにすることを目指す。
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