ラット初代培養肝細胞を用いた高リン刺激伝達経路の解明

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H00943
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 中井 雄治 弘前大学, 地域戦略研究所, 教授 (10321788)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西塚 誠 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (00363953) ; 岡田 晋治 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (50376563) ; 永長 一茂 弘前大学, 地域戦略研究所, 准教授 (70401891)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: リンシグナル / DNAマイクロアレイ / 初代培養肝細胞 / 遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、高リン刺激が脂質代謝のシグナル伝達を解明することを目的として、ラット初代培養肝細胞を用いて遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイで明らかにし、その遺伝子発現を誘導する上流因子の解明を目指す。令和5年度は、令和4年度に決定した条件で培養・刺激し、細胞からトータルRNAを回収してDNAマイクロアレイ解析を行う予定であったが、令和5年度もラット初代培養肝細胞の入荷が遅れたため、生物種は異なるが入手しやすいヒト肝がん由来細胞株であるHepG2細胞を用いて、ラット初代培養幹細胞を想定した条件で実験を行った。具体的には、昨年度初代培養肝細胞で決定した条件に近い条件で、24 well plateに1.25×10^5の密度で播種、3 mM・10 mMのリン酸塩添加（リン酸塩の終濃度それぞれ4 mM・11 mM）で15分あるいは30分刺激した後、RNeasy micro kit（QIAGEN）のbuffer RLTで回収し、カラム精製を直接行った。その結果、初代培養幹細胞よりやや収量は増えたもののオーダーまでは変わらず、RNA収量は回収法によらずほぼ細胞数に依存すると考えられた。今後は初代培養肝細胞をこれまでよりも大量に用意し、6 well plate以上のスケールで培養・刺激し、遺伝子発現変動をDNAマイクロアレイで解析する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

世界的な情勢による流通の遅れにより、ラット初代培養肝細胞の入荷が遅れ、予定した実験内容を変更したため、全体的に遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

今後は、 まずHEP134-M細胞 を今年度ブラッシュアップする条件で培養・刺激し、細胞からトータルRNAを回収してDNAマイクロアレイ解析を行う。取得したマイクロアレイデータをもとに、コントロール群と高リン刺激群で発現に差がある遺伝子の選抜を行う。次に、得られた発現変動遺伝子から、上流の転写因子やシグナルに関わる分子等の内在性因子／経路を予測できるIngenuity Pathway Analysisソフトウェアを用い、高リン刺激の影響を受ける転写因子や経路を推定する。今回の初代培養肝細胞の結果と、過去に解析した単回投与の結果を比較し、どの部分が共通していて、どの部分が異なるのかを明らかにする。共通している部分に着目し、検証する因子の候補を複数ピックアップする。さらに、ピックアップした候補因子ついてのノックダウン実験を、HEP134-M細胞を用いて行う。