2022 Fiscal Year Annual Research Report
アミロイド触媒型の原始酵素モデルに着想した人工酵素のデザインと応用
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22H01873
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
真壁 幸樹 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (20508072)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 紀生 名古屋大学, 情報学研究科, 教授 (10390650)
矢野 成和 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (50411228)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アミロイド触媒 / βシート |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では触媒活性のあるアミロイド（アミロイド触媒）の部分配列を我々がこれまで研究してきたペプチド会合模倣体（PSAM）へ移植し、球状タンパク質上で活性を詳細に評価を行う。
これまでのアミロイド触媒で亜鉛をヒスチジンに配位させた構造が報告されているため、この構造の模倣から研究を開始した。PSAMのβシート上の片面にヒスチジンを24箇所と8箇所導入した変異体を作製した（それぞれCat-H24およびCat-H8と命名）。これらは人工遺伝子合成サービスを利用して、目的遺伝子を作った。
Cat-H24およびCat-H8遺伝子を大腸菌組換え体として発現し、Ni-NTAカラムにて精製を行った。精製後のサンプルのpoly-Hisタグをスロンビン消化にて切断除去したサンプルを調製した。CDスペクトルにて元のPSAMと同様のβシートに富んだ構造を有していることを見出した。また、サイズ排除クロマトグラフィーの結果から、Cat-H24は実験条件にて主に二量体、Cat-H8は主に単量体として存在していることが明らかとなった。
この二種類のPSAM変異体について、触媒活性をエステル加水分解と脱リン酸化反応で評価した。これら２つの反応を利用した理由は、反応生成物として色を持つ分子が生成する系を利用することで、簡便に反応速度論を評価することができるためである。触媒反応測定の結果、Cat-H24はエステル加水分解活性を持ち、金属イオンが不要であることが明らかとなった。これは報告のあるアミロイド触媒とことなるため反応メカニズムの解明を進めていく。また、脱リン酸化反応ではマグネシウムイオン依存的にCat-H24の触媒活性が現れることが明らかとなった。
以上から、現時点でアミロイド触媒の触媒活性を移植したモデル蛋白質分子の設計に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
設計したβシートモデルタンパク質を組換え体蛋白質として作製・精製に成功しており、二次構造特性や会合状態の評価を完了した。また、活性測定でエステル加水分解活性とリン酸脱離活性があることが明らかとなった。このため、本研究課題を進行する上で予定通りのスタートが実現できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
触媒活性評価から、当初の予定通りの活性を得ることができた。このため、より詳細な活性評価とその構造解析について研究を進めていく予定である。また、どのような反応に関して触媒活性を持っているのか明らかにするため、ATPの加水分解活性測定を開始する。エステルの加水分解反応では分担者が基質結合に関して分子シミュレーションで評価する方法を試行しており、分子シミュレーションも進めていく予定である。
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