2022 Fiscal Year Annual Research Report
Biosynthesis of secondary metabolites with unique nitrogen-containing structures from actinobacteria
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22H02192
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
勝山 陽平 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (50646437)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ジアゾ基 / 亜硝酸 / 生合成 / 放線菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Azaserineの生合成機構の解析に関して
Azaserineはヒドラジノ酢酸 (HAA) から生合成される。そこで、HAAがどのような反応を経てazaserineへと変換されるか解析を試みた。まず、HAAから2-hydrazineylideneacetyl基への変換反応の検証を行った。HAAから2-hydrazineylideneacetyl基への変換反応は過去に生合成経路が報告されているtriacsin生合成経路と同様に起こると予想された。そこで、これらの生合成に関わると予想される、AzsS, AzpP, AzsQ, AzsFの組換えタンパク質を精製し、それらの機能をin vitroで解析した。しかし、反応が最後まで進行しなかった。そこで、AzsTをさらにこの反応に加えたところ、キャリアータンパク質であるAzsQに結合した2-hydrazineylideneacetyl基の合成が確認された。さらに下流の反応を触媒すると予想された、AzsD, AzsN, AzsO, AzsBの解析を試みた。合成した基質を用いて反応を行った結果、これらの酵素が働くことで、O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineが合成されることが示された。この化合物がさらになんらかの酸化酵素によって酸化されることで、azaserineが生合成されると予想される。
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成機構に関して
Nybomycinの生合成経路において2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成を担うと予想される3つの酵素 (NybC, N, O) をStreptomyces albusで異種発現した結果、この化合物のN-acetyl化体が得られていた。そこで、これらの酵素を一つずつ発現系から除き、どの酵素が生合成に必須か確認した結果、いずれの酵素も2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に必須であることがわかった。さらに、これらの酵素を用いてin vitro解析を試みたが、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成をin vitroで再現できなかった。そのため、未知の補酵素などが、これらの反応に必要な可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Azaserineの生合成研究においてはin vitro解析を用いて、azaserineの生合成経路のほとんどの反応を解析することに成功した。また、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に関しては異種発現系を用いた解析により、着実に反応に必要な要素が絞り込めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Azaserineの生合成機構に関して
O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineからazaserineの合成を触媒する酵素の候補は2つ存在する。これらの異種発現系を用いた破壊により、中間体の検出とそれらが実際にジアゾ基の生合成に必要か確認する。次に、これらの酵素のin vitro解析をこころみる。O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineを有機化学的に合成し、それを用いてin vitro解析を行う。また、azaserineの類縁体を生産すると考えられる二次代謝産物生合成遺伝子クラスターが複数見つかっている。これらの異種発現を通して新規なジアゾ基含有化合物の発見を目指す。
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成機構に関して
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成酵素のin vitro解析を目指す。これらの酵素と放線菌の細胞抽出物などをもちいてin vitro反応を行い、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成に必要な因子の特定を目指す。また、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成遺伝子を持つ、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを異種発現し、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸由来の新たな天然物の発掘を目指す。
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