2023 Fiscal Year Annual Research Report

相同組換え効率の向上を目指したＤＮＡ修復機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number	22H02237
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	澤山茂樹京都大学, 農学研究科, 教授 (80357178)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Keywords	DNA修復機構 / ゲノム編集 / ラビリンチュラ / 微細藻類 / 緑藻
Outline of Annual Research Achievements	本研究課題「相同組換え効率の向上を目指したＤＮＡ修復機構に関する研究」は、外来ＤＮＡの相同組換えが難しい多くの真核生物について、ＤＮＡ修復機構の謎解明を目指した研究である。ストレス条件で培養すると相同組換え効率が向上するラビリンチュラ類を中間型モデル生物とし、相同組換え効率が低い生物の原因解明を本研究の目的とする。ラビリンチュラ類の知見を緑藻と比較しながら、３つのＤＮＡ修復機構、相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）について研究を進めている。微細藻類やラビリンチュラ類は、ＤＮＡ修復機構に関わる遺伝子が未知なものが多く、その制御機構や転写解析も進んでいない。前年度の本研究では、Aurantiochytrium limacinumについて、光や浸透圧ストレス条件における網羅的転写データを取得し、京都大学化学研究所スーパーコンピュータシステムを利用し、広範なデータからの注釈付を行うことでＤＮＡ修復機構関連候補遺伝子を探索した。今年度は、A. limacinumについて、ＨＲ関連Ｍｒｅ１１タンパク質の過剰発現やゲノム編集のためのＣａｓ９タンパク質の発現実験を行ったところ、従来のベクターを用いた形質転換法では、一度ゲノムに挿入された外来遺伝子が、抗生物質選択寒天培地における継代培養で、早期に脱落することが明らかになった。そこで、外来遺伝子が脱落しにくいベクターを構築し、ＨＲ関連タンパク質の過剰発現やＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子のノックアウト・ノックダウン実験を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の目的は、「どうして多くの真核生物は、外来ＤＮＡを用いた相同組換え（ＨＲ）が起きづらいのか？」という学術的な問いに対する答えを用意することにある。そのために本研究では、ＨＲが起きやすい酵母とＨＲが特に起きづらい緑藻の中間に位置するラビリンチュラ類Aurantiochytrium limacinumをモデル生物として用いる点が、学術的独自性と創造性が高い特色である。A. limacinumは、ストレス条件で培養するとＨＲ効率が向上すると考えられている。ラビリンチュラ類の知見を緑藻と比較しながら、３つのＤＮＡ修復機構、相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）について研究を進めている。微細藻類やラビリンチュラ類は、ＤＮＡ修復機構に関わる遺伝子が未知なものが多く、その制御機構や転写解析も進んでいない。前年度の本研究では、京都大学化学研究所スーパーコンピュータシステムを利用し、広範なデータからの注釈付を行うことでＤＮＡ修復機構関連候補遺伝子を探索することができた。今年度は、A. limacinumについて、Ｍｒｅ１１タンパク質の過剰発現やゲノム編集のためのＣａｓ９タンパク質の発現実験を行ったところ、従来のベクターを用いた形質転換法では、一度ゲノムに挿入された外来遺伝子が、抗生物質選択寒天培地における継代培養で、早期に脱落することが明らかになった。そこで、外来遺伝子が脱落しにくいベクターを構築し、ＨＲ関連タンパク質の過剰発現やＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子のノックアウト・ノックダウン実験を進めている。これらの結果から、重要な資源生物であるA. limacinumにおいて、外来遺伝子が脱落しやすいという新たな学術・応用面で重要な知見を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	（サブテーマ③ラビリンチュラＤＮＡ修復機構の改変）前年度までのサブテーマ①において、低塩濃度ストレス条件等におけるA. limacinumのＨＲ・ＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子の転写情報等を解析し、ＨＲ効率を向上させるターゲット遺伝子を探索した。補助事業期間中のサブテーマ③においては、前年度探索したＨＲ関連ターゲット遺伝子を過剰発現し、先に確立したＨＲ効率評価系によりＨＲ効率を確認する。また、ＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子ＤＮＡライゲースIVやポリメラーゼシータ等について、ノックアウト・ノックダウン実験を進めてＨＲ効率への関与を明らかにする研究を進める。（サブテーマ④緑藻ＤＮＡ修復機構の改変）前年度までのサブテーマ②において、C. reinhardtiiのＨＲ・ＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子の転写情報等の解析と、A. limacinumのデータを参考に、ＨＲ効率を向上させるターゲット遺伝子を探索した。補助事業期間中のサブテーマ④において、前年度探索したＨＲ関連ターゲット遺伝子の過剰発現方法を検討する。さらに、A. limacinumのＨＲ効率評価実験を参考に、ＮＨＥＪ・ＭＭＥＪ関連遺伝子について、ノックアウト・ノックダウン実験方法を検討し、ＨＲ効率に影響する遺伝子に関する研究を進める。