2023 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of the redox dynamics of phosphorous by in-situ mearsurement
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22H02243
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
廣田 隆一 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (90452614)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | リン / 酸化還元 / 嫌気培養 / 亜リン酸 / 独立栄養細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までの研究において、亜リン酸センサー菌（淡水性藍藻）の生育限界亜リン酸濃度の確認を実施し、約5.0μMの亜リン酸が存在すれば十分に検出できる事が確認できた。また、バイオアッセイによる環境亜リン酸の検出系を構築し、淡水条件では0.1μMの検出限界値を示す測定系を構築した。しかしながら、本バイオアッセイで使用するRalstonia sp.由来亜リン酸デヒドロゲナーゼ（PtxD)は塩類（マグネシウム、カルシウム、アンモニウム）に対して高い感受性を示したため、濃縮された環境水サンプルにおいては期待された性能を発揮できないことが明らかとなった。そこで、今年度は様々なバクテリアが持つPtxDをデータベースで探索し、そのうち４種類について組換えタンパク質を作製し、その活性を評価した。その結果、海洋性藍藻Cyanothece sp. 由来のPtxD（Ct-PtxD)は非常に高い塩耐性を示し、塩濃度が高いサンプルにおいても有効な亜リン酸測定系として利用できることが明らかとなった。また、環境中の独立栄養性亜リン酸酸化細菌(DPOM)のサンプリング範囲を拡大し、スクリーニングを実施した。主に広島沿岸部から大阪湾にかけての瀬戸内海、有明海、一部鹿児島県の沿岸部にてサンプリングを実施した。その結果、複数のサンプルからDPOM活性が検出され、DPOMの環境分布の一般性が示唆された。また、集積培養を行ったDPOMの培養液からDNAを抽出し、ショットガンメタゲノム解析を実施した。現在、得られたデータの解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
スクリーニングを行った70箇所以上のサンプルのうち、15サンプル以上からDPOM活性が検出され、予想以上にDPOMが多様な環境に分布していることが明らかになった。またこれらの解析から、DPOMのゲノムおよび代謝様式の多様性に関する知見が多く得られている。さらにこれらのショットガンメタゲノム解析により亜リン酸代謝系遺伝子クラスターの比較および系統解析が可能な情報も得られつつある。亜リン酸の検出においては、当初予定していたバイオアッセイへの予期せぬ課題が見つかったものの、新規亜リン酸デヒドロゲナーゼの単離によってこの課題を回避することができた。以上のことから、本研究は当初の計画以上に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は、得られたメタゲノムデータの解析を行い、各地点から得られたDPOMのゲノム構造、予測代謝経路の比較およびその多様性解析を行う。また、ロールチューブ法によって集積培養系からDPOMの単離を試みる。これにより、DPOMのゲノムが単一化されれば、株単位でのゲノム解析および代謝経路の予測をおこない、メタゲノム情報との整合性を評価する。また、+III価のリン化合物であるホスホン酸の生合成経路との関係性も調査する。以上の結果を包括的に評価し、リンの生物循環への貢献を考察する。
また、亜リン酸センサー菌を活用したマイクロコズム試験も行う。既に予備的な実験を完了しており、マイクロコズム環境での生存期間の見積もり等が完了している。同条件で詳細な評価を行い、亜リン酸センサー菌の増殖により亜リン酸の有無を推測する。さらに、DPOM由来亜リン酸デヒドロゲナーゼの組換えタンパク質の精製を行い、亜リン酸からのエネルギー生成系の解析にも取り組む。
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