2023 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the molecular mechanisms by which pectin interacts with small intestinal cells
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22H02285
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
矢部 富雄 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (70356260)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志水 元亨 名城大学, 農学部, 准教授 (20423535)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | ペクチン / 小腸上皮細胞 / α-グルコシダーゼ / siRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，水溶性食物繊維の一種であるペクチンを経口摂取した際の腸内での生理作用メカニズムの解明を目指し，「小腸を構成する細胞はペクチン分子中の特異的多糖構造を認識してペクチンに応答している」という仮説を立て，これを立証するために，小腸を構成する細胞に発現するタンパク質と相互作用する多糖構造の同定を目的としている。昨年度までに，ペクチンの主鎖構造のメトキシ化度の違いが腸管由来タンパク質のフィブロネクチンとの相互作用に影響することを見出した。そこで，本年度は栄養吸収上皮細胞と同様に小腸においてペクチンと直接接触する可能性が高い粘膜固有層マクロファージに注目し，マウスRAW264.7細胞を株化モデル細胞として使用し，応答を調査した。その結果，LPSによって刺激された炎症性サイトカインIL-6の分泌を抑制する効果ばかりではなく，LPS刺激群と同程度に免疫賦活作用があるものも確認された。このため，免疫細胞に対するペクチンの直接的な作用を解析するにはさらに詳細な実験系の構築が必要と判断し，当初の計画を変更して，栄養吸収上皮細胞において栄養吸収に関与する酵素であるリパーゼとα-グルコシダーゼに対するペクチンの影響を調査した。その結果，リパーゼへの影響は少なかったものの，α-グルコシダーゼに対しては活性阻害作用を示すペクチンの構造が見られ，さらにペクチン分解酵素を用いて分子構造限定的に分解して影響を検討したところ，ペクチン側鎖に存在するアラビナン構造が阻害活性に重要な構造であることを見出した。さらに，ペクチンを認識して細胞内に情報を伝えるレセプターを同定するため，候補レセプターであるMuc13について，siRNAを用いて発現量を低下させ，ペクチンに対する応答を測定する実験系を構築することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では，腸管においてペクチンと相互作用する因子の探索を網羅的に行う目的で，栄養吸収上皮細胞に加えて粘膜固有層マクロファージに注目してその影響について調査する予定であったが，先行研究で得られている結果とは異なる影響が見られたため，慎重に条件検討が必要と判断し，免疫細胞に対してのペクチンの相互作用については次年度以降でさらに検討することに計画を変更した。そこで，本年度は栄養吸収上皮細胞に対する影響をさらに詳細に追求するため，栄養吸収に関係する酵素に注目してペクチンとの相互作用とその影響について調査したところ，α-グルコシダーゼに対する活性阻害作用が確認され，この作用はペクチンの側鎖構造中のアラビナンが大きく影響していることが示唆された。さらに，これまで想定していないようなペクチンと相互作用するレセプターの探索を目指して，栄養吸収上皮細胞上で発現する候補となるレセプタータンパク質をsiRNAによる発現低下によってペクチンの影響を調査する新たな実験系の構築にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，ペクチンを試料として，腸オルガノイドを用いた作用機序の解明に取り組む。ペクチンは，経口摂取される食品成分であることから，小腸を構成する細胞群に影響を与える際には，まず小腸上皮細胞を介した応答を経なければならない。そこで，マウス由来小腸幹細胞から構築した腸オルガノイド(人工腸管)の管腔内にペクチンをマイクロインジェクションし，腸組織における構造としての陰窩や絨毛への影響を形態学的に検討する。また，ペクチンに応答して小腸上皮からシグナル因子が分泌され，他の組織・臓器へと運ばれて作用することも考えられるため，腸オルガノイドにペクチンを注入した際にマトリクスゲル側(生体の基底膜側に相当し，血管を介して肝臓に運ばれる)に分泌される因子を収集し，メタボローム解析によりペクチンに応答して分泌される因子を同定する。さらには，小腸を構成する細胞群に対するペクチンの影響を網羅的に解析するため，腸オルガノイドを一般的な3D培養系で構築するのみならず，単層(2D)培養系を構築し，ペクチンに応答した際の遺伝子発現への影響を解析する。また，今年度に構築した細胞内のペクチンに対する応答に関与することが想定されるタンパク質を欠損させる実験系を腸オルガノイドでも構築し，ペクチン添加時の影響を確認する。
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