2022 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular basis for developing antiviral genetic resources derived from host genes by genome editing with in-frame deletions
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22H02343
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中原 健二 北海道大学, 農学研究院, 講師 (90315606)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
薦田 優香 酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (90716482)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / インフレーム変異 / 植物ウイルス / 抵抗生育種 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はトマト遺伝子をゲノム編集することで新たなウイルス 抵抗性遺伝資源の開発を目指している。これまでの研究でトマト遺伝子のインフレーム(3の倍数)の塩基欠失 型編集(iGE)で特異的に抵抗性が付与される場合を複数見出した。本研究でiGE遺伝子から発現する変異蛋白質がウイルス感染を阻害していることを立証し、新たなウイルス抵抗性遺伝資源開発戦略を確立を目指す。①トマトの翻訳開始因子eIF4E1コード領域の9塩基欠失アレル(eIF4E1_9DEL)によるキュウリモザイクウイルス(CMV)抵抗性については、これまでの研究でCMVの2bタンパク質と結合する可能性が見出されていた。本年度はまず、酵母ツーハイブリッド法によりeIF4E1_9DELおよび野生型のeIF4E1が共に、2bのC末端部分との親和性を介して結合していることを明らかにした。また、スプリットルシフェラーゼ相補解析により植物細胞内で、eIF4E1_9DELおよび野生型eIF4E1がCMV 2bと結合することが示された。また、これまでにeIF4E1_9DELは2bのRNAサイレンシング抑制活性を阻害している可能性が見出されている。②トマトの受容体用リン酸化酵素BAM2のiGEアレルによるトマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)抵抗性については、12塩基欠失のiGEアレルから発現する変異タンパク質が、TYLCVのC4と結合していることが酵母ツーハイブリッド法で示唆され、C4の機能を阻害することでTYLCV感染を阻害している可能性が示唆された。③RNaseダイサー様タンパク質(DCL)3によるTYLCVについては、DCL3_6DELとDCL_2DEアレルを持つトマトが得られ、繰り返しTYLCVの接種試験を行った結果、iGEのDCL_6DELではなく、ノックアウト(KO)アレルのDCL_2DELを持つトマトが抵抗性を示すと結論した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
トマトの３つの遺伝子のiGEアレルについて解析を進めており、この内、eIF4E1とBAM2のiGEアレルの抵抗性についての解析は、ほぼ、当初の予定通り進められている。一方で、DCL3の編集トマトについて、iGEアレルではなくKOアレルが抵抗性を示すことが明らかになった。予備実験とは違う結果になり、計画の変更が必要ではあるが、このDCL3_2DELによる抵抗性も従来のウイルス感染に必要な感受性因子の遺伝子破壊による抵抗性とは考えづらい。なぜなら、DCLはウイルスに対する主要な防御機構であるRNAサイレンシングの主要因子だからである。この抵抗性の背景メカニズムを解析することでも新たな抵抗性育種戦略につながる成果が得られる可能性があるのではないかと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
3つのiGEアレルによる抵抗性それぞれについて以下のように研究を進める。①eIF4E1_9DELによるCMV抵抗性については、eIF4E1_9DELが2bのRNAサイレンシング抑制活性をどのように阻害しているのか、背景メカニズムとして二つの可能性を検証する。一つは、2bの2本鎖RNA結合を阻害している可能性、もう一つは、2bのオートファジーによる分解を結合することで阻害している可能性について検討する。また、eIF4E1_9DEL過剰発現形質転換トマトが作出できれば、そのCMV抵抗性がより向上することを確かめる。②BAM2のiGEアレルについては、12延期欠失に加えて、3塩基、6塩基、144塩基欠失のiGEアレルが得られており、それらのTYLCV抵抗性について比較検証するとともに、他のウイルス、トマト黄化えそウイルス(TSWV)抵抗性についても試験する。③DCL3＿2DELによるTYLCV抵抗性については、KOアレルであるため、そこから変異タンパク質が発現してTYLCVの感染を阻害していることは考えにくく、なぜ抵抗性になるのか、まずはTYLCVを接種したDCL3＿2DELトマトからRNAを抽出して抵抗性関連の遺伝子発現誘導について、TYLCV接種野生型トマトと比較する。また、DCL3タンパク質とTYLCVタンパク質の相互作用についても酵母ツーハイブリッドで調べてみる。これらの実験で、DCL3_2DELによるTYLCV抵抗性のメカニズムについて考察し作業仮設を設定する。
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