2023 Fiscal Year Annual Research Report
Neural mechanisms and evolution of the control of behavioral expression in higher centers of the insect brain
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22H02357
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
木矢 剛智 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (90532309)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | カイコ / ショウジョウバエ / 性差 / スプライシング / doublesex / fruitless |
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| Outline of Annual Research Achievements |
外界からの感覚情報に対する適切な行動発現は、動物の生存や種の維持に重要である。その神経回路の動作機構や進化の理解は、生物学において重要な未解明の課題の一つである。本課題の解決には、哺乳類に比べ極めてシンプルな昆虫の脳を用いた包括的な解析が有効である。また、昆虫の性フェロモンは、入力（感覚情報）と出力（性行動）が明確に対応しているといった特徴がある。これまでに本研究者は、カイコガ・ショウジョウバエの脳において活動依存的に神経回路を可視化する手法を新規に確立し、昆虫の脳高次領域において性フェロモンに応答する神経回路を同定してきた。本研究は、これらの神経回路の動作機構を解析し、性フェロモンが性行動の発現を制御する神経機構を解明することを目的としている。また、カイコガとショウジョウバエのような進化的に離れた昆虫種間で、神経回路機構の共通性と相違性を明らかにし、昆虫脳の進化（特に性行動に関わる脳機能の進化）を解明することも目的としている。
本年度は以下の項目について重点的に研究を進めた。１．性特異的なスプライシングを示す新規遺伝子の解析、２．Bmdsx-GAL4系統を用いたDSX発現細胞の解析
また、昨年度投稿した論文がPNASにおいてリバイズを経て出版となった。さらに本年度に投稿したfruitlessノックアウトカイコの解析についての論文もIBMBより出版した。また、共同研究として行っていたcaged-アセチルコリンの研究がアメリカ化学学会のJACSより出版された。
以上の点から、本研究は当初の想定以上に進展したと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
１．性特異的なスプライシングを示す新規遺伝子の解析
これまでのカイコガを用いた研究において、ショウジョウバエで性行動の制御に重要なdsxやfruitlessをノックアウトしたカイコガ系統を解析したところ、これらの因子がなくともオスのカイコガは性行動を示すことが出来ることを見出してきた。このような背景から、カイコガの脳の性差を決定する別な因子があることを想定したスクリーニングを行い、雌雄間で異なったスプライシングを示す新規な転写因子を2つ同定した。本年度は、これらをノックアウトしたカイコガ系統の作出に取り組んだ。遺伝子名の詳細は伏せるが、片方の遺伝子（仮に遺伝子Aとする）は脳に特異的に発現する遺伝子であったことから、こちらのノックアウト系統の作出を重点的に行った。一方、別の遺伝子についてもノックアウト系統の作出に取り組んだが、結果的には成功しなかった。遺伝子AはZ染色体に座上しており、ノックアウトによってメスがヘミ致死となってしまい、ホモ変異の成虫個体を得ることが出来なかった。そのため、本遺伝子が性行動の制御に関与するかについて、決定的な解析を行うことは出来なかった。一方、カイコの卵巣由来の細胞であるBmN4細胞において性特異的なスプライシングを再現させる系を確立した。これまでのところ本系を用いて性特異的なスプライシングを操作した実験が行えることを確認できた。
２．Bmdsx-GAL4系統を用いたDSX発現細胞機能の解析
カイコガにおいてdoublesex遺伝子座にGAL4をノックインしたBmdsx-GAL4系統を詳細に調べたところ、精巣のシスト細胞において最も顕著に発現していることが分かった。このことを利用し、DSX発現細胞をGFPで可視化し、FACSによってシスト細胞をソートし、SMART-Seqによって遺伝子発現の解析を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
①CaイメージングによるaSP2神経回路の活動動態の解析
今後は、本年度には時間的に手が回らず遂行できなかった、aSP2神経回路の解析を行う。本解析ではaSP2神経回路においてどのように情報の統合が行われているのかといったことを、Caイメージングによって明らかにする。aSP2神経選択的にGCaMP（Caインジケータータンパク質）を発現させたショウジョウバエのオスを用い、メスの性フェロモン刺激を触角（嗅覚神経）および前足先端部（味覚神経）に与えaSP2神経回路の活動動態を解析する。特に嗅覚と味覚を介した性フェロモン刺激を同時に与えるとどのような神経活動の加算や統合が見られるのか明らかにする。本解析により、複数種類の感覚情報が脳内で統合される機構について明らかにする。
②aSP2神経が性行動指令の神経回路（P1神経）の活動を制御する機構の解析
aSP2神経回路は性行動を指令するP1神経の上流に位置している。昨年度までの解析により、当初の予想に反して、aSP2神経回路はグルタミン酸ではなく、アセチルコリン放出を介した神経伝達が重要であることを確認してきた。このアセチルコリン入力がP1神経の活動をどのように制御するのかといった点について、①と同様のCaイメージングによって解析を行う。
③カイコガ脳高次領域の神経回路の進化的保存性の解析と新規分子機構の解明
これまでに、雌雄の脳でスプライシングパターンが異なる新規な遺伝子を２つ発見し、そのうちの一つについてはノックアウト系統を作出した。本年度はこの変異体を用いた遺伝子機能の解析と脳の性決定における役割の解析を行う。また、カイコの卵巣由来細胞BmN4を用いてスプライシングパターンを人工遺伝子において解析できる系を立ち上げたので、これを用いてオス化シグナルによる、新規遺伝子のスプライシング制御機構について詳細な解析を行う。
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