2022 Fiscal Year Annual Research Report

Development of a method for the control of mass mortality in the pearl oyster using immune memory-like phenomena.

Research Project

Project/Area Number	22H02440
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	松山知正国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), グループ長 (20372021)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	梅田剛佑国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 任期付研究員 (20792443) 松浦雄太国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 任期付研究員 (40823894)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Keywords	アコヤガイ / 大量死 / ウイルス
Outline of Annual Research Achievements	本課題を申請した時点では、アコヤガイの大量死の原因は不明であったが、採択されるまでの期間中にEntomobirnavirus属に比較的近縁なビルウイルスが原因であることがほぼ特定できた。採択後は、超遠心法等により本ウイルスを精製し、ＮＧＳ解析により精製度を確かめるとともに感染試験を実施し、大量死の原因であることを確認した。ここでは病原体の仮の名称としてPiBV（Pinctada birnavirus）を用いる。定量PCRと免疫染色により、PiBVは外套膜に感染し、感染から数日以内に急増し、1週間以降には速やかに減少することが明らかとなった。PiBVの感染試験における死亡率は、数ヶ月齢の稚貝では50%を超えるが、1歳以上のアコヤガイでは殆ど死亡しなかった。感染から1か月が経過し、体内のウイルス量が検出限界にまで減少した1歳のアコヤガイに対して、再度PiBVを感染させたところ、体内でのPiBVの増幅は、初回感染よりも少ないことが明らかとなり、アコヤガイにおける免疫様現象の存在が示唆された。脊椎動物の免疫機構のように、本病に見られた記憶様現象がPiBVに特異的であるのかを検証するために、アコヤガイに感染する本病とは無関係なビルナウイルスを感染させ、1か月後にPiBVを感染させたところ、PiBVの増殖は抑制されなかった。よって、PiBV感染症に見られた免疫様現象は、何らかの特異性を持つと考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 本年と次年度は、アコヤガイの大量死の原因病原体の特定と定量法の確立、感染試験による免疫様現象の確認を計画していた。病原体の特定は難航すると考えていたが、予想に反して本課題が採択される前に殆ど特定に近い段階まで研究が進捗した。そのため、本課題では病原体の証明に必要となる、精製ウイルスを用いた感染試験を実施し、計画よりも大幅に早く病原体の特定とその定量法の確立を完了できた。感染試験による免疫様現象の確認も順調に進捗している。これらのことから、当所の計画以上に進展しているとした。
Strategy for Future Research Activity	昨年度までに本大量死の原因は昆虫を宿主とするEntomobirnavirus属に比較的近縁なビルナウイルスであることを明らかにした。本課題の申請時に予測した通り、本ウイルスは感染後から数日以内に急増し、比較的速やかにアコヤガイの体内から減少することが明らかとなった。さらに、再感染時における本ウイルスの増幅は、初回感染よりも少ないことが示され、アコヤガイにおける免疫様現象の存在が示唆された。本年度は、免疫様現象を担う臓器を特定するために、感染を経験した個体の各種臓器（あるいは臓器から調整した細胞）を、非感染個体へ移植したのちに感染試験を行い、感染を防御にかかわる臓器を調査する。あるいは、容器中で各種臓器組織片に対して感染試験を行い、健常群と感染を経験した群で本ウイルスの増幅が異なる組織を探索し、防御にかかわる臓器を調査する。また、免疫様現象の特異性を検証するために、本病とは無関係なウイルスや、ウイルス感染を模倣する2本鎖RNAを投与し、感染防御が成立するか調査する。さらに、免疫様現象のメカニズムを解析するために、感染後の遺伝子発現状況を網羅的に解析する。