Generating xenogeneic gametogenesis by the noble system

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H02496
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 山城 秀昭 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (60612710)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 学 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: エピゲノム編集 / 異種胚盤胞補完法 / 異種配偶子産生

Outline of Annual Research Achievements

動物種の壁を越えた異種配偶子産生システムを技術として確立し、産業に応用できる革新的技術に繋げるには、広範な動物種への適応が必要である。本研究は、異種胚盤胞補完法、エピゲノム技術および多能性幹細胞技術を融合し、げっ歯類のラットおよび大型産業動物であるウシの生殖巣および生殖細胞を性成熟までの2ヶ月で小型実験動物のマウス生体内で作製する異種配偶子産生システム(Xenogenric In Vivo Gametogenesis; X-IVG)システムを確立し、さらに、生殖細胞形成の”種を越えた普遍性の解明”という新たな要素を加え、家畜生産短期化に応用できる革新的技術を開発する。この目的のために、(1)エピゲノム編集技
術による生殖細胞を欠損した胚盤胞補完受容胚用マウスの作製、(2)生殖細胞を欠損したマウス胚盤胞を用いたラット生殖細胞の作製とその産子作出、(3)ウシ多能性幹細胞の樹立、(4)生殖細胞を欠損したマウス胚盤胞を用いたウシ生殖細胞の作製、(5)マウス生体内で作製したウシ生殖細胞からの受精卵と産子を獲得、(6) 種を越えた生殖細胞発生に共通する未知の因子を同定する実験を実施する。これらの研究から、家畜個体から切り離した形で、マウス体内でウシ生殖細胞を作出して産子生産に適用する、新たな家畜繁殖と育種の短期化を実現する革新的な技術の確立を図る。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和4年度では、DNAメチル化を制御するCRISPRoffシステムを導入したマウス作製に関する実験を実施いた。まず、米国addgene社より購入したCRISPRoffプラスミドをベクターに必要である領域をPCRにより増幅させ、In-Fusionクローニングと、Gatewayクローニング法のLR反応によってターゲティングベクターを作製した。ターゲティングベクターをエレクトロポーレーション法によりES細胞に導入し、G418薬剤耐性ES細胞を選抜した。相同組換え体はPCR法とサザンブロットハイブリダイゼーション法の2段階のスクリーニングによって同定した。キメラマウスの作製は、同定されたES細胞をICR系統マウスの８細胞期胚にインジェクションし、24時間後に偽妊娠マウスの子宮に移植した。その結果、現在まで5匹の雄キメラ産子の獲得に成功した。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度は、作出したキメラマウスの交配を重ねることでCRISPRoffホモノックインマウスの作製を得るとともに、同時にgRNAマウスの作製にも取り組むこと、CRISPRoffシステムを導入したマウス作製を目指す。