2023 Fiscal Year Annual Research Report
Generating xenogeneic gametogenesis by the noble system
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22H02496
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
山城 秀昭 新潟大学, 自然科学系, 教授 (60612710)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 学 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
菅原 淳史 東北大学, 大学病院, 助教 (00554403)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | CRISPRoff / エピジェネティクス / CRISPRoffノックインマウス / gRNAノックインマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在のゲノム編集ツールにおいて、CRISPR/Cas9は簡便かつ迅速に高い効率であらゆる遺伝子のノックアウトやノックインを可能にするが、オフターゲット効果や内在的な修復に依存しており、挿入や欠損がランダムに発生する。一方で、塩基配列を変えることなく遺伝子の機能を制御するDNAメチル化が注目され、2021年にはDNAメチル化転移酵素をCRISPR/Cas9に応用したCRISPRoffシステムが報告された。このシステムは、標的遺伝子への特異性が高く、長期的なメチル化の維持を可能にした。しかし、このシステムはヒト培養細胞でのみ報告されており、マウスなどの生体で機能させた報告はない。そこで令和5年度の研究では、CRISPRoffシステムを導入したマウスのエピジェネティクス研究への応用を目的とし、CRISPRoffノックインマウス、gRNAノックインマウスの作製に取り組んだ。またin vitroでのCRISPRoffの機能性を検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①相同組換えES細胞のインジェクションによって、10匹の雄キメラ産子の獲得に成功した。さらに、自然交配によってCRISPRoff発現マウス（ヘテロ）を獲得した。
②Nanos3-gRNAベクターを使用して2回、Prdm14-gRNAベクターを使用して2回GONAD法を行った結果、Nanos3では27匹中1匹のKI個体が得られ、Prdm14では9匹の産子を得たが、KI個体は得られなかった。
③各処理区は対照区と比較して、Prdm14の相対発現量は、1～2割の減少であり、対照区に対して有意な変化は見られなかった。
哺乳類においてDNAメチル化は主に遺伝子プロモーター領域のCG（シトシングアニン）配列のシトシンがメチル化される。遺伝子は、1.プロモーター領域にGC配列を多く含む領域（CpGアイランド）が存在する遺伝子2.遺伝子内部にCpGアイランドが存在する遺伝子3.プロモーター領域、遺伝子内部どちらにもCpGアイランドが存在しない遺伝子の3種類に類別できる。この内、主にDNAメチル化よる遺伝子発現の抑制が生じるのは1のみであるとされている。実験で対照とした遺伝子であるPrdm14はプロモーター領域にCpGアイランドが存在しない。③の結果から、Prdm14の遺伝子発現量の変化が見られなかった原因は、Prdm14の遺伝子発現の制御はDNAメチル化によって行われるのではなく、別のエピジェネティクスが関与している可能性が推察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPRoff発現マウスのホモ個体を作製し、Nanos3-gRNAマウスとの交配を行い生体でのCRISPRoffシステムの機能性を評価する。また、DNAメチル化解析で利用されるバイサルファイトシーケンスやMSP（メチル化特異的PCR）などにも着手し、DNAメチル化に関するより詳細な解析を行う予定である。
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