2023 Fiscal Year Annual Research Report
狂犬病ウイルスと組織透明化を用いた排便制御に関わる中枢神経の網羅的解析
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22H02523
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
内藤 清惟 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (30794903)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 直人 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (20334922)
志水 泰武 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (40243802)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 排便 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ストレスによる排便障害が大きな問題となっているが、その病態は明らかになっていない。これは、中枢神経系がどのように排便を制御しているのか、に関する情報が不足していることが理由の一つになっている。そこで本研究では、狂犬病ウイルスと組織透明化という新規手法を用いて、排便に関わる全ての脳領域をスクリーニングし、中枢神経による排便制御システムを明らかにすることを目的とする。本研究により、この分野の研究を飛躍的に進展させることを目指し、ストレスによる排便障害の病態の解明、新たな治療法・予防法の開発に貢献する。
消化管の運動は大腸に存在する内在神経系と、脳と脊髄からなる中枢神経系によって制御されている。これまでの研究では、消化管にしか存在しない特殊な神経系である内在神経系に注目が集まっていて、中枢神経系に着目した研究は少なかった。これまでに私たちは、中枢神経系に着目した排便制御の研究を行い、その機能の一部を明らかにしてきた。本研究では中枢神経系による排便制御の解明を目指し、近年発達してきた組織透明化と狂犬病ウイルスを用いたトレーサー実験によって、排便制御に関わる脳領域の特定する。
これまでの研究から、脳のノルアドレナリン作動性神経、ドパミン作動性神経、セロトニン作動性神経が中枢神経による排便制御に重要な役割を果たすことが明らかとなっている。本研究では、これらの神経を含む脳領域およびこれまで明らかになっていない脳領域に関して、排便に関わる脳領域の特定を行う。本年度は、レポーター遺伝子を組み込んだ狂犬病ウイルスによって発現した蛍光タンパク質を全脳領域についてスクリーニングを行った。スクリーニング効率を改善するために、新規顕微鏡システムの改良を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度も狂犬病ウイルスと組織透明化を用いたトレーサー実験を実施した。レポーターとなる蛍光タンパク質を感染した細胞で発現させる狂犬病ウイルスをマウスの末梢組織に投与し、経時的に採取した脳を透明化することで、全脳領域についてレポータータンパク質の発現を検討した。これによって、末梢に投与したレポーター狂犬病ウイルスによって、脳において蛍光タンパク質が発現しており、レポータータンパク質の発現が脳領域によって偏りがあることを確認した。しかしながら、全脳領域についてデータとして記録、解析するためには、既存の蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡では非常に長い時間の撮影が必要となるため、サンプルへのダメージが問題になる点や、実験速度をあげることが難しいなどの問題点も洗い出されたため、先端バイオイメージング支援プラットフォーム（ABiS）の支援を受け、新規顕微鏡システムを構築し、数－十数時間かかっていたデータの取得を、数分で実施することが可能となった。しかしながら、マウスに最適化された顕微鏡システムであったため、ラットの全脳を検索するための改良を実施し、マウス脳よりも大きなサンプルの解析が可能な顕微鏡システムを構築することができた。次年度以降に行う全脳領域の検索について、実際のデータとして記録、解析を実施する環境を構築することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、本年度に確立したレポーター狂犬病ウイルスを大腸に投与し、組織透明化と新規顕微鏡システムを用いて大腸運動制御に関わる脳領域の特定を引き続き行う予定である。また、狂犬病ウイルスベクターの投与後の適切なサンプル採取時間の検討も引き続き行う予定である。麻酔した動物の腹腔を切開し、消化管壁内にレポーター狂犬病ウイルスを投与する。投与後、経時的に脳を採取し、透明化した後に観察し、レポーター蛍光タンパク質が発現する領域について全脳領域を検索する。レポーター狂犬病ウイルスによって、レポーター蛍光タンパク質を発現している神経の性質を解析するために、透明化した組織の免疫染色を実施する。また、得られたデータの論文化を進める予定である。
また、実験の過程において、中枢神経系においてコレシストキニンが排便制御に関わることを見出しており、そのメカニズムについても検証を進める予定である。
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