新規direct-cKOシステムでの必須遺伝子探索とその網羅的解析基盤の構築

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H02535
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10633141)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 綾部 信哉 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (10633563) ; 久野 朗広 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60830122)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 必須遺伝子 / 遺伝子改変マウス

Outline of Annual Research Achievements

生存や増殖という最も重要で基礎的な生命イベントの基本原理を理解するためには必須遺伝子の特定が欠かせない。多細胞生物は、形態や役割が異なる非常に多くの細胞種同士が緊密に協調し、その生命体を構成・維持するが、各細胞種間で必須遺伝子がどの様に異なるのかは不明である。各細胞種におけるそれぞれの細胞必須遺伝子の特定は、多細胞生物の生命維持機構の基本原理の理解に直結する。しかし、解析の困難性から、in vivoでの網羅的な必須遺伝子探索はほとんど実施されていない。そこで、「マウス成体の各組織での細胞必須遺伝子の特定を可能とする実験リソース及び解析系を確立」を目的とする研究を行った。
まず、必須遺伝子の候補リストを公開されているマウスゲノムデータベースから抽出したところ、その遺伝数は190であった。次にこれらの遺伝子をそれぞれ破壊できるベクターの構築を行った。その結果、177種類のベクターをそれぞれ個別に構築することに成功した。そのうちのいくつかについて、実際に遺伝子破壊をする能力があるのかを培養細胞にて確認したところ、確認したすべてのベクターが破壊活性を有していた。また、ここで構築した全種類のベクターには赤色蛍光タンパク遺伝子も搭載させた。
次に上述のベクターを導入する遺伝子改変マウスの確立を行った。このマウスは、標的とする内在性遺伝子破壊が生じていない細胞でだけEGFPが発現する遺伝子カセットを持つ。3種類の遺伝子改変マウスを確立し、その破壊および蛍光タンパク発現活性を評価した結果、一系統が有望な結果を示した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

最も難しいと思われたベクターライブラリの構築が90%以上の成功率で完了した。また、それらを導入するための遺伝子改変マウスの樹立と活性評価も完了しており、次年度からすぐに表現型解析を実施できる体制が整った。

Strategy for Future Research Activity

ここまでに構築したベクターをそれぞれ個別に標的とする内在性遺伝子破壊が生じていない細胞でだけEGFPが発現するマウスに導入する。本システムを利用すれば、原理的には、いずれの細胞系譜でも特異的な遺伝子破壊が可能となる。本課題では時間的な制約もあるために、proof of conceptとして一つの細胞系譜に絞り解析を実施していく予定である。