2022 Fiscal Year Annual Research Report
狙ったDNAが過剰メチル化された疾患モデル動物作製法の開発
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22H02537
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
堀居 拓郎 群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (00361387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 純代 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (40589264)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | エピゲノム編集 / DNAメチル化 / dCas9 / プラダー・ウィリー症候群 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAメチル化をはじめとするエピジェネティック修飾は、遺伝子発現や染色体構造を制御し、その破綻は様々な疾病を引き起こすと考えられる。これまでに我々は高効率エピゲノム編集法を開発し（Nat Biotechnol 2016）、標的領域のDNA脱メチル化により、インプリンティング疾患であるシルバー・ラッセル症候群のエピゲノム編集モデルマウスの作製に成功した（Genome Biol 2020）。一方、DNAの過剰メチル化による疾患モデル動物の報告はまだない。その原因として、導入したDNAの過剰メチル化状態を個体で維持することが難しい点が挙げられる。令和4年度は、DNAメチル基転移酵素であるDnmt3aやDnmt3bに加え、補因子であるDnmt3lやKRABなどをマウス初期胚で共発現することにより、安定したメチル化編集法を確立することを試みた。Dnmt3aまたはDnmt3b単独による過剰メチル化導入では、数日でメチル化状態が元に戻ってしまうことから、補因子であるDnmt3lやKRABの共発現によりエピゲノム編集状態が長期間維持されるのか検討した。過剰メチル化の標的として、PWSの原因領域と考えられているSnrpn-DMRを選択した。マウスES細胞に、エピゲノム編集の最小単位であるdCas9-SunTagとscFv-Dnmt3b、Snrpn-DMRに対するgRNA（６種類）の発現ベクターに加え、Dnmt3lおよびKRAB強制発現ベクターをトランスフェクションし共発現させた。１ヶ月間継代培養したところ、Dnmt3bとKRABを組み合わせた場合に、最も安定的にDNAメチル化が維持された。Dnmt3b単独またはKRAB単独では十分なメチル化導入と維持を行うことができなかった。一方、Dnmt3lはDNAメチル化の長期維持に必ずしも必要な因子ではなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書で計画した研究を全て予定どおり遂行できたため、この評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に検討したうち、最も効果的かつ持続的にメチル化状態を維持できる発現ベクターの組み合わせを使って、モデルマウス作製を行う。発生工学的手法として、下記３法を予定している。
①トランスジェニック（TG）マウスの作製と胎子期のDNAメチル化解析：各種エピゲノム編集ベクターを線状化あるいは環状のまま受精卵の前核に注入し、エピゲノム編集胚を作製する。処理胚を偽妊娠マウスの卵管に移植し、妊娠中期（妊娠12.5日前後を予定）に回収する。胎子のメチル化解析を行い、Snrpn-DMRの過剰メチル化の維持とそれに伴う発現異常が惹起されているのか確認する。
②４倍体補完によるES由来個体の作製と胎子期のDNAメチル化解析：過剰メチル化させたES細胞を４倍体の宿主胚（胚盤胞）に注入し、キメラ胚を作製する。キメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、妊娠中期（妊娠12.5日前後を予定）に回収する。４倍体補完法では、宿主胚は胎盤としてのみ寄与するため、得られる胎子はほぼ完全にES細胞由来細胞からなる。胎子のメチル化解析を行い、Snrpn-DMRの過剰メチル化の維持とそれに伴う発現異常が惹起されているのか確認する。
③キメラマウスの作製と胎子期のDNAメチル化解析：過剰メチル化させたES細胞を宿主胚（胚盤胞）に注入し、キメラ胚を作製する。キメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、妊娠中期（妊娠12.5日前後を予定）に回収する。回収した胎子をトリプシン消化し、繊維芽細胞（MEF）を作製する。フローサイトメーター（FACSAriaII）を用いて、ES由来細胞の寄与率の測定とソーティングを行う。ES由来細胞についてメチル化解析を行い、Snrpn-DMRの過剰メチル化の維持とそれに伴う発現異常が惹起されているのか確認する。
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