2023 Fiscal Year Annual Research Report
Development of in situ SPA with wedge-shaped sample
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22H02559
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
加藤 貴之 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20423155)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高崎 寛子 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (50610432)
寿野 良二 関西医科大学, 医学部, 准教授 (60447521)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析法 / 楔形試料 / 集束イオンビーム / FIB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質は生命活動の根幹であり、タンパク質の機能異常は病気を引き起こす。また、ウイルスなどの病原体は特定のタンパク質に結合することで感染が開始されるため、タンパク質を知ることは病気の治療や創薬のおいて最も重要な要素である。近年の創薬は構造情報に基づいた"Structure based drug design"が主流である。そのため、自然な状態のタンパク質の構造情報を得る手法は創薬の基盤技術になり得る。一般的に創薬に用いることができる高分解能な構造情報は細胞内から精製されたタンパク質を用いられ、細胞内で今まさに機能しているタンパク質の構造情報を高分解能で得る方法は未だに確立していない。本研究では凍結させた細胞を収束イオンビーム（FIB）を用いて、楔形に切削し、十分に薄い場所のみをクライオ電子顕微鏡にて撮影し、単粒子解析法を用いて細胞内のタンパク質の構造を解析する方法を確立することを目的としている。
FIBは試料を非常に薄く切削できるが、通常の方法では高分解能な情報を得るには不十分であるため、昨年度に続き、楔形試料の切削の条件を検討した。特に自動切削と組み合わせた場合の１試料の作成時間、FIB装置からクライオ電子顕微鏡まで移送する際の力学的な安定性の注意し、実験を行なった。
酵母を用いて切削を行ったところ、手前が薄く、奥が厚い楔を作ることでクライオ電子顕微鏡で撮影するに耐える均一で薄い試料の作製に成功した。電子線トモグラフィーの一般的な試料作成手段に従うと、横幅がおおよそ20 umよりも大きな試料の場合は力学的に強度が足りず、しばしば試料の移動の際に崩落するが、楔形試料だと幅50 um程度まで安定であることを確認した。この広さの試料の場合、単粒子解析に使う領域は倍以上となり撮影効率が劇的に改善する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
奥が薄く、手前が厚い楔形試料だと薄い部分がきれいにならず、撮影効率が悪かったが、楔の形を逆にすることで、均一で薄い試料の作製の成功率が劇的に改善した。また、切削の方法の改善と楔試料の幅の検証を行ったところ、通常の倍位以上の幅の試料であっても力学的には安定で、移動の際に破損することがなくなった。得られた楔を使って単粒子解析を現在進めており、いくつかの問題点を改善しながら順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では試料作成が全ての鍵を握っており、そのための条件検討は長い時間を要することが予想される。クライオ電子顕微鏡による撮影は多くの部分が自動化され、1日に6,000-10,000枚の画像が撮影できる。2022年度段階では楔を作成することができたが、１楔に対して15箇所程度しか画像を撮影することができなかった。しかし、2022年度の装置のアップデートによって自動化が進み、１度に作製できる楔の数は変わらないが、人的なコストを削減することに成功した。2023年度のアップデートによって作業できる時間が18時間から48 時間に大幅に延長されたこと、幅を倍以上に拡張できることによって、クライオ電子顕微鏡での撮影速度に耐えうるグリッドを1回のFIB利用によって可能になると期待している。2024年度は単粒子解析によって細胞中での蛋白質粒子の高分解能構造解析に挑む。
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