大腸菌BepAによる外膜タンパク質トリアージ機構とその制御

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H02571
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 秋山 芳展 京都大学, 医生物学研究所, 教授 (10192460)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森 博幸 京都大学, 医生物学研究所, 准教授 (10243271)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 外膜タンパク質 / 表層プロテアーゼ / トリアージ / 分子シャペロン / 大腸菌

Outline of Annual Research Achievements

細菌外膜は、菌の生存に必須の機能を持つ。本研究は、大腸菌BepA proteaseによる外膜タンパク質の運命選別 (トリアージ)とその制御機構を解明し、外膜構造と機能の維持におけるその意義の理解をめざすものである。外膜タンパク質LptDは、外膜機能に必須のリポ多糖の生合成に働く。 申請者らは、BepAが、外膜のBAM複合体(外膜タンパク質トランスロコン)上で正常なLptD分子は外膜へのアセンブリーを促進し(Chaperone様機能)、異常分子は分解除去する(Protease機能)、 即ちトリアージすることで、外膜の構造と機能維持に働く事を示したが、その分子機構の詳細や生理機能の全容は不明である。申請者らが2019年に解明したBepAの結晶構造では、protease 活性部位がα6 loop とα9 loop と名付けた二つのループ領域に覆われて分子内に深く埋没した構造をとっている。基質が活性部位にアクセスするためには、これらが大きく構造変化し、活性部位領域が露出するものと予想された。α6 loop とα9 loopは一部が密接に相互作用しており、この相互作用がこれら領域の可動性に関わる可能性が考えられた。これらを踏まえて、α6 loop とα9 loopの相互作用部位に存在するイソロイシン194残基を様々な残基に置換し、BepA活性に対する影響を調べたところ、それらの変異体発現株では、野生型BepA発現株と異なり、正常にアセンブリーをしているLptD分子もBepA依存的に分解されることがわかった。これらの結果は、α6 loop とα9 loopとの相互作用が BepAの機能制御に重要であることを示唆するものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

システマティックな変異解析により、BepA機能制御にα6 loop とα9 loop相互作用が関わる事を示唆する手掛かりを得た。

Strategy for Future Research Activity

予定通り、さらなる変異解析や再構成系を用いた解析等を通じてBepAの機能制御機構を明らかにする。また、作製した変異体の構造解析や生化学的アプローチによるBepA構造変化の実態解明も進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] National University of Singapore/Nanyang Technological University(シンガポール)
  • Country Name: SINGAPORE
  • Counterpart Institution: National University of Singapore/Nanyang Technological University
• [Journal Article] Inner membrane YfgM-PpiD heterodimer acts as a functional unit that associates with the SecY/E/G translocon and promotes protein translocation. (2022)
  • Author(s): Miyazaki, R., Ai, M., Tanaka, N. , Suzuki, T., Dhomae, N., Tsukazaki, T., Akiyama, Y., and Mori, H.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 298 Pages: 102572
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102572
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP. (2022)
  • Author(s): Imaizumi, Y., Takanuki, K., Miyake, T., Takemoto, M., Hirata, K., Hirose, M., Oi, R., Kobayashi, T., Miyoshi, K., Aruga, R., Yokoyama, T., Katagiri, S., Matsuura, H., Iwasaki, K., Kato, K., Kaneko, M. K, Kato, Y., Tajiri, M., Akashi, S., Nureki, N., Hizukuri, Y., Akiyama, Y., and Nogi, T.
  • Journal Title: Sci. Adv Volume: ８ Pages: eabp9011
  • DOI: 10.1126/sciadv.abp9011
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structure of an entire AAA protease complex FtsH-HflKC. (2022)
  • Author(s): Qiao, Z., Yokoyama, T., Yan, X.-F., Beh, I. T., Shi, J., Basek, S., Akiyama, Y., and Gao, Y.-G.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 39 Pages: 110890
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110890
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A photo-crosslinking approach to monitor assembly of an LptD intermediate with LptE in a living cell. (2022)
  • Author(s): Miyazaki, R., Mori, H., and Akiyama, Y.
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 2548 Pages: 97-107
  • DOI: 10.1016/10.1007/978-1-0716-2581-1_7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] グラム陰性細菌が環境の鉄を感知する分子機構 大腸菌鉄獲得系のシグナル 伝達を担う一回膜貫通タンパク質 FecR の膜挿入と連続的切断反応の解析 (2022)
  • Author(s): 横山達彦、秋山芳展
  • Organizer: 第18回大腸菌研究会
• [Presentation] 膜内タンパク質切断の制御機構の解明に向けた細菌由来 Site-2 protease の構造生物学的研究 (2022)
  • Author(s): 今泉友希 、髙貫一徳 、大井里香 、坂口(田村)梨沙子 、三好賢一 、有賀 理江 、廣瀬建 、片桐静夏 、三宅拓也 、檜作洋平 、秋山芳展 、禾晃和
  • Organizer: 第18回大腸菌研究会
• [Presentation] 結晶構造に基づく菌膜内切断プロテアーゼRseP の基質取り込み・切断機 構の解析 (2022)
  • Author(s): 三宅拓也、今泉友希、髙貫一徳、小林達也、横山達彦、大井里香、檜作 洋平、禾晃和 、秋山芳展
  • Organizer: 第18回大腸菌研究会
• [Presentation] VemP-Bla レポーター系を用いた分泌モニター因子 VemP の翻訳停止の解除に関わる cis-element, trans 因子の同定とその作用機序の解明 (2022)
  • Author(s): 池田優希、秋山芳展、森 博幸
  • Organizer: 第18回大腸菌研究会
• [Presentation] 細菌膜内切断プロテアーゼRsePの基質取り込み・切断時におけるダイナミックな構造変化モデル (2022)
  • Author(s): 三宅 拓也、今泉 友希、高貫 一徳、小林 達也、横山 達彦、大井 里香、檜作 洋平、禾 晃和、秋山 芳展
  • Organizer: 第95会日本生化学会大会
• [Presentation] 大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePのTM4領域に着目した基質エントリーゲートの制御機構の検証 (2022)
  • Author(s): 小林 達也、三宅 拓也、今泉 友希、高貫 一徳、横山 達彦、大井 里香、檜作 洋平、禾 晃和、秋山 芳展
  • Organizer: 第95会日本生化学会大会
• [Presentation] 大腸菌S2Pファミリー膜内切断プロテアーゼRsePの切断基質の系統的解析による基質認識・切断特異性の検証 (2022)
  • Author(s): 檜作 洋平、古味 大雄、秋山 芳展
  • Organizer: 第95会日本生化学会大会
• [Presentation] 翻訳アレストペプチドVemPを介した遺伝子発現制御における転写産物の動態解析 (2022)
  • Author(s): 石井英治、秋山芳展、森博幸
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会