2022 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of MTCL proteins which regulate assembly structures of microtubules based on the Golgi membrane.
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22H02621
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
鈴木 厚 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (00264606)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仁田 亮 神戸大学, 医学研究科, 教授 (40345038)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | MTCL2 / ゴルジ体 / 微小管 / 小脳顆粒細胞 / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)「MTCL2のゴルジ近傍領域への局在機構の解明」-- MTCL2のゴルジ局在を担うと予想されているCLASP2分子上の結合部位はTOG3領域とC末端CLIP ID領域それぞれにあること、ただし十分な結合が実現するにはその両者が相乗的に働く必要があること明らかになった。また、CLASP2のゴルジ体局在にもMTCL2の存在が必要であることが今回新たに示され、MTCL2の結合がCLIP ID領域を介したCLASP2のゴルジ体結合を促進している可能性も示唆された。一方、MTCL2のN末端領域のゴルジ体へのリクルートには、GiantinのN末端コイルドコイル領域が必要であること、そして両者が物理的に結合を示すことも明らかとなった。
2) 「MTCL2がER-Golgi間輸送を抑制する機構の解明」-- Rushシステムを用いたManII-GFPの輸送を検出する安定発現HeLa-K細胞株を作成することに成功した。これにより、安定なデータを得ることか可能となり定量的な解析およびライブイメージング解析が大きく進んだ。そして、ERに発した小胞(ERGIC)の輸送を、MTCL2の働きによってゴルジ体近傍に集積させられた微小管が阻害し、ゴルジ体との融合を阻害している可能性が示された。
3) 「MTCL2が小脳顆粒細胞の樹状突起伸長を促進する機構の解明」-- ライブイメージング観察によって、小脳顆粒細胞・樹状突起の発達が、二極性に長く伸びた神経突起が短縮化し、ダイナミックに短縮と伸長を繰り返す多数の多方向性の樹状突起に変化する嘉永であることが明らかとなった。そして、変異体を用いたノックダウン/レスキュー実験から、樹状突起の多極性化にはMTCL2のゴルジ体との結合が必須であること、しかし、その短縮化/動的不安定化にはMTCL2のゴルジ体結合は必要ではなく微小管結合活性が必要であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度初期には、6つのコイルドコイル領域を含むMTCL2ゴルジ体結合領域(約430アミノ酸)を組み換えタンパク質として大腸菌から精製することににかなりのエネルギーを注いだ。しかし、大きな凝集体を形成する傾向が示され、安定に精製できずに終わった。また、結合相手側のCLASP2分子上の結合領域も2つのドメインを含む広範囲な領域にまたがるという予想外の結果が得られることなった(上記概要参照)。したがって、MTCL2のゴルジ体結合の分子機構の解明には、かなりの困難が予想される。
ただ、当初の計画では想定していなかった困難や実験事実に遭遇するのは研究を進める上での常であり、その他の研究については、概要に記したような順調な結果が種々得られている。以上から、上記のような研究到達度の評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)「MTCL2のゴルジ近傍領域への局在機構の解明」-- CLASP、GiantinがMTCL2のゴルジ局在領域のどの部分に結合するのかを免疫沈降法によって次に明らかとする。この結果を手掛かりとして、Giantin, CLASPそれぞれとのMTCL2結合が、MTCL2のゴルジ体局在にいかに関わっているのか、その相互関係に関する作業仮説を構築する。
2)「MTCL2がER-Golgi間輸送を抑制する機構の解明」-- HeLa-K細胞で確認したER-Golgi間輸送に対するMTCL2の抑制機構が、他の細胞にも普遍的にみられる現象か否かを検討する。一方、外来性のManII-GFPの輸送について明らかにしたこの抑制が、細胞内在性の膜、あるいは分泌タンパク質の輸送に対しても働いているか否かについても検討する。ゴルジ体やERGICのマーカーのRFP融合タンパク質とManII-GFPを同時に発現した細胞のライブイメージングを進めることによって、MTCL2が、ER-Golgi輸送のどの部分を抑制してるのかという点についても、より詳細でクリアな結果を得ることを目指す。
3)「MTCL2が小脳顆粒細胞の樹状突起伸長を促進する機構の解明」-- 歴史的に、小脳顆粒細胞の分化・極性化過程を詳細に検討した研究が非常に不足しており、この基礎データの不足が、MTCL2の作用機序を明らかとする上でのネックとなっている。このことから、まずこの点を克服することを目指し、まずは野生型の小脳顆粒細胞を用いて、その極性化過程におけるゴルジ体、中心体の動きと神経突起/樹状突起伸長の関係に関するライブイメージング解析を進める。また、EB3-GFPを用いて、各発達段階における神経突起/樹状突起内の微小管の方向性や動的不安定性についての基礎データを集める。
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Research Products
(8 results)
