2022 Fiscal Year Annual Research Report
B3転写因子による乾燥ストレス応答において機能するペプチド受容シグナルの制御機構
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22H02650
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
高橋 史憲 東京理科大学, 先進工学部生命システム工学科, 准教授 (00462698)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 環境応答 / 植物ホルモン / タンパク質リン酸化 / 転写調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
乾燥ストレス応答におけるペプチド－受容体の下流で機能する細胞内分子制御機構の解明を目的として、ABA合成酵素の発現を制御するB3転写因子に着目し、その機能解析を行った。GFP融合B3転写因子を野生型およびbam受容体変異体に導入し、乾燥ストレス条件下でのABA合成酵素の発現変動を解析した。その結果、B3-TF-GFP/野生型では、ABA合成酵素の発現がストレス条件下で高発現したのに対し、B3-TF-GFP/bam変異体では、ABA合成酵素の発現が抑制されていた。これらの結果は、B3-TFがBAM受容体の下流でABA合成酵素の発現を制御していることを示す。次に、共免疫沈降法によりB3-TF-GFPを野生型およびbam変異体から抽出した後、高分解能質量分析装置を用いて、乾燥ストレス条件におけるB3-TFのタンパク質修飾を解析した。その結果、B3-TFは乾燥ストレス依存的にリン酸化修飾を受けることを明らかにした。このリン酸化修飾部位は複数存在したため、リン酸化部位を含む周辺のアミノ酸配列を指標にモチーフ検索を行った結果、環境ストレス応答で機能する代表的なタンパク質リン酸化酵素のターゲット配列が含まれることを明らかにした。そこで複数のタンパク質リン酸化酵素群に着目し、野生型およびbam変異体を用いてGFP融合過剰発現植物体を作成した。またin vitorリン酸化アッセイを確立する目的で、GSTやMBPタグを融合させた各種タンパク質リン酸化酵素群およびB3-TFのコンストラクションを作成し、大腸菌内で培養し精製タンパク質の準備を進めた。これらの結果から、ペプチド－受容体の下流において、B3-TFがタンパク質リン酸化酵素による制御を受けてABA合成酵素の発現を制御しているシグナル伝達経路の存在を明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
B3-TF-GFP/野生型、およびB3-TF-GFP/bam変異体を用いた解析から、本研究で着目しているB3-TFがBAM受容体の下流でABA合成酵素の発現を制御していることを明らかにすることができた。この結果は、本年度の重要な研究成果の一つである。また、高分解質量分析装置を用いた解析から、B3-TFがストレス依存的にリン酸化修飾を受けること、またこの修飾がBAM受容体依存的におこることを明らかにできた。特にリン酸化修飾部位のアミノ酸配列から、B3-TFをリン酸化する候補因子群を類推できた点が、次年度につながる成果である。この修飾部位は複数存在したことから、B3-TFは様々なタンパク質リン酸化酵素によって修飾を受け、複雑で多段階的な活性制御を受けて、機能していることが推測できる。これらの結果を踏まえて、現在、GFPだけでなくGSTやMBPといった様々なタグを融合させた過剰発現植物体、および大腸菌を用いたタンパク質精製を進めている。これらの作成が終わり次第、タンパク質リン酸化酵素の活性を測定したり、B3-TFを実際にリン酸化する酵素の同定を行う。また、B3-TFがリン酸化修飾を受けるアミノ酸に着目し、リン酸化状態を模倣するアスパラギン酸への置換、および脱リン酸化状態を模倣するアラニンへの置換を複数箇所において進めている。これらのコンストラクションが終了次第、B3-TFの転写活性化能の解析や、ABA合成酵素の発現制御への関与を解析することができるため、これらの準備も計画通り進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
乾燥ストレス条件下でのbam変異体における各種タンパク質リン酸化酵素の活性変化について、ゲル内リン酸化アッセイやラジオアイソトープを用いないアッセイ系の確立を行う。現在、様々なタグを付加したタンパク質リン酸化酵素の過剰発現植物体の作出を進めていることから、これら植物体を用いてin vivoでの酵素活性を測定する。また、野生型およびbam変異体に乾燥ストレス処理を行った後、高分解能質量分析装置を用いて、網羅的なリン酸化プロテオーム解析を行っている。これらの解析結果を取得次第、データをまとめBAM受容体の下流で機能する新規なタンパク質リン酸化酵素の同定を進める。また、現在進めているB3-TFへのアスパラギン酸置換、およびアラニン置換を行ったコンストラクトを用いて、B3-TFの転写活性化能の解析や、ABA合成酵素の発現制御への関与を解析する。さらにこれらのコンストラクトをシロイヌナズナの葉肉細胞から作成したプロトプラストに一過的に導入し、B3-TFの細胞内局在を解析する。アミノ酸の変異によって主に核への細胞内局在の変化や、浸透圧やペプチド処理による細胞内局在の変化を解析する。また野生型から作成したプロトプラストだけでなく、bam変異体からもプロトプラストを作成し同様の実験を行い、比較解析することで、BAM受容体の下流で機能するB3-TFの詳細な機能解析を進める。また、これらのコンストラクトを野生型植物体およびbam変異体に感染させることで、過剰発現植物体の作成も進める。植物体の選抜が終了次第、in plantaでのB3-TFの機能解析も同様に行うことができる。さらにこれらの形質転換植物体は、B3-TFをリン酸化するタンパク質リン酸化酵素とも組み合わせることで、多重変異体および多重過剰発現植物体の作成も進め、解析を行う。
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Research Products
(6 results)
