2022 Fiscal Year Annual Research Report
アクティブゾーン分子複合体の動態制御機構と多様性の理解
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22H02717
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
大塚 稔久 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40401806)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
萩原 明 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (70402849)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アクティブゾーン / CAST / ELKS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はアクティブゾーンの分子構造基盤と神経伝達物質放出の変動に着目し、アクティブゾーンの核心因子であるCAST/ELKSによる分子複合体の動態制御機構を明らかにすることである。今年度では細胞レベルにおけるCAST/ELKSの液-液相分離とRIM1（Rab3-interacting molecule 1）-Rab3相互作用について総合的な解析をした。その結果、CASTとELKSは高頻度で液滴を形成したが、RIM1の液滴形成は低頻度であった。さらに、RIM1の液滴はほとんどが核で形成された。FRAP（Fluorescent Recovery After Photobleaching）による液滴流動性の評価においては、RIM1の核内液滴が最も流動性が高く、CASTが最も流動性が低い結果を得た。注目すべきことに、CASTまたはELKSとRIM1を共発現させると、RIM1の核内液滴は減少し、細胞質の液滴は著しく増加した。さらに、RIM1液滴の流動性は、CASTおよびELKSと結合することにより減少した。RIM1はRab3のエフェクターであり、CAST/ELKSが介在する液-液相分離によるRIM1-Rab3相互作用への影響を解析した。その結果、液-液相分離によりRIM1-Rab3の相互作用が促進されることがわかった。
一方、海馬ニューロンを用い、CASTとELKSの近傍に局在する因子を、近位依存性ビオチン標識法により分離・精製し、質量分析により同定した結果、およそ260因子を同定することができた。同定された因子群では、アクティブゾーン構成因子群のほか、シグナルやプロテオスタシス関連因子を含んでおり、CAST/ELKSによるアクティブゾーンサーベイランスの分子基盤として期待された。今後、詳細な解析を行う計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
おおむね当初の計画通り進展しているため。特にアクティブゾーンにおける空間的プロテオミクスの系を確立できたこともあり、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
CAST/ELKSが介在する液-液相分離によるRIM1-Rab3相互作用の促進メカニズムを分子レベルで解明する。そのため、液-液相分離の阻害剤である1,6-hexanediolを添加し、CAST/ELKSが介在するRIM1の液滴形成を抑制した状況において、Rab3との相互作用がどのように変動するかを解析する。また、液-液相分離しないELKSのN末端欠失変異体と共発現させ、RIM1-Rab3相互作用を解析する。
CAST/ELKS近位依存性ビオチン標識によるプロテオーム解析では、領域を拡大し、脳組織においても同様の解析を行う。シナプスアクティブゾーン周辺部のプロテオーム情報を取得することにより、神経伝達におけるアクティブゾーンの役割を解明するための基盤を構築する。さらに、前年度実施した海馬ニューロンでの近位依存性ビオチン標識によるプロテオーム解析の結果から仮説を立て、同定因子との相互作用を評価する。
アクティブゾーンにおけるCAST/ELKSの役割を明らかにするために、海馬ニューロンでのCAST/ELKSターゲティング戦略を確立する必要がある。CAST/ELKSのダブルフロックスマウスから海馬ニューロンを培養し、Cre recombinaseを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを作製する。感染タイミング、AAVの量、感染後回収時期などを検討し、CAST/ELKS脱落によるアクティブゾーンの変動を解析する。さらに、電気生理学的解析を組み合わせることにより、構造と機能の相関性を中心的に解析する。Cre recombinase発現AAVをCAP-B10セロタイプで作製し、静脈を介した全脳感染系を樹立する。CAST/ELKS遺伝子の脱落から生じる神経変動を、生化学・免疫組織化学・電気生理学の手法を駆使し解析する。
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[Journal Article] Ubap1 knock-in mice reproduced the phenotype of SPG80.2022
Author(s)
Shimozono, K., Nan, H., Hata, T., Saito, K., Kim, YJ., Nagatomo, H., Ohtsuka, T., Koizumi, S., Takiyama, Y.
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Journal Title
Journal of Human Genetics
Volume: 67
Pages: 679-686
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Novel SLC9A6 Variation in Female Carriers With Intellectual Disability and Atypical Parkinsonism.2022
Author(s)
Nan, H., Kim, YJ., Tsuchiya, M., Ishida, A., Haro, H., Hiraide, M., Ohtsuka, T., Takiyama, Y.
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Journal Title
Neurology Genetics
Volume: 8
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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