Research on the roles of neural crest derived cells in the pulmonary development .

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H02774
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 江本 憲昭 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (30294218)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 神経堤細胞 / 肺 / エンドセリン / 慢性閉塞性肺疾患 / 気管支肺異形成

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、「肺における神経堤に由来する細胞が、外環境の酸素濃度を感知して、出生直後の肺胞形成およびその後の肺の恒常性維持に重要な役割を果たす」という仮説に対し、エンドセリン系を切り口として、分子遺伝学的手法やイメージング法を駆使して解明することを試みるものである。
当該年度は下記3つのアプローチで研究を進めた。
①シングルセルRNAシーケンス解析による肺胞形成、恒常性維持に重要なシグナルの同定：生後0.5日のET-2遺伝子欠損マウスと野生型マウスの肺から調製したRNAを用いて、シングルセルRNAシーケンスによる網羅的な解析を行った。その結果、ET-2の欠損により肺に活性化された好中球で構成される分画が新たに出現していることが明らかとなった。これらの細胞が出生直後の呼吸開始とともに出現したのかどうかを確認するために出生直前の胎児を帝王切開で取得し、調製した検体を用いてシングルセルRNAシーケンス解析を実施したところ、呼吸開始前から肺に活性化された好中球が出現していることが明らかとなった。
②ET-2レポーターマウスの作出：ET-2の遺伝子座に超高輝度発光タンパクの機能を持つYeNL2.0-CL1-PEST遺伝子をノックインしたマウスをCRISPER/Cas9システムを用いて作出した。マウスは発生学的な異常をきたさず発育しており、生体イメージングの手法を用いてET-2の発現を確認する。
③モデル動物を用いたアプローチ：野生型マウスを用いてエラスターゼで処置した慢性閉塞性肺疾患（COPD）のモデルマウスの作成を試みた。フレキシベントを用いた呼吸機能検査および肺の組織学的解析でCOPDを誘発できていることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題は予定された研究計画通りに進捗しているため。

Strategy for Future Research Activity

今後も引き続き肺における肺胞形成および恒常性維持の分子機構に迫る研究を推進する。具体的には、ET-2の欠損が肺において活性化された好中球の分画を誘導するメカニズムを解明する。また活性化された好中球が肺胞形成を阻害するメカニズムを解析する。これらの目的を達成するために、誘導型ET-2遺伝子欠損マウスを作出し、生後の肺胞形成において異なるタイミングでET-2遺伝子を欠損させ、肺から調製した検体を用いてシングルセルRNAシーケンス解析を実施し、肺で変化する少数細胞の発現遺伝子を抽出し、肺の表現型発現に関与する重要な細胞クラスタや情報伝達経路を同定する。
また、作出したET-2レポーターマウスを用いて、生体におけるET-2の発現の観察を試みる。
ET-2の病態における役割の解明のために、気管支肺異形成（BPD）および慢性閉塞性肺疾患（COPD）のモデル動物の作成・解析を継続する。