2022 Fiscal Year Annual Research Report
Transport mechanisms of cell-penetrating peptides at the blood-retinal barrier to establish strategies of macromolecular drug delivery
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22H02780
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
赤沼 伸乙 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (30467089)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉尾 直孝 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50722261)
細谷 健一 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (70301033)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 血液網膜関門 / 細胞膜透過ペプチド / 受容体 / トランスサイトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度においては血液網膜関門 (BRB) における細胞膜透過ペプチド (CPP) 輸送機構が高分子の網膜デリバリーに有用であることの実証に向けた研究を推進した。毛細血管内皮細胞にて構成される内側血液網膜関門 (inner BRB) を対象として、内皮細胞における透過性を示すCPPであるangiopep-2について詳細な輸送特性解析実施に向けて、緑色蛍光タンパク質 (GFP) や5/6-carboxyfluorescein (FAM)、そして125Iにてそれぞれ標識したangiopep-2の合成に成功した。その中で、GFPにて標識したangiopep-2についてマウスへ静脈内投与後、網膜組織内においてGFP由来のシグナルが検出された。このシグナルはangiopep-2標識されていないGFP投与時には観察されなかったことから、GFPへのangiopep-2付加は網膜へのGFP移行性を高めることが示唆された。この網膜移行性向上にinner BRBが関わるかを、我々が新たに確立した多細胞性in vitro実験系、inner BRBスフェロイドを用いて解析を行った結果、GFP標識angiopep-2およびFAM標識angiopep-2共に担体介在型にてinner BRBを透過することが示され、この担体介在型輸送はGFPおよびFAMでは見られなかった。従って、inner BRBにおいてangiopep-2付加分子を認識する輸送機構が存在することが示唆された。本成果の一部はJ. Control. Releaseへ原著論文として投稿しており、本実績報告書提出時において、すでに受理・掲載済みである (J. Control. Release, 8-21 (2022))。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に記載したように、angiopep-2とタンパク質・低分子・放射性同位元素との結合体の合成は成功している。そのため、現在継続して実施しているBRBを介した輸送の特性解明と、それを担う分子実体同定に向けた、標識化材料の作出はすでに完了していると言える。さらに、inner BRBのin vitro解析を簡便に実施可能な多細胞性スフェロイドの確立にも成功しており、各種学会における成果発表や論文としての投稿を通じ、その客観的評価・信頼性もすでに得ている。そのため、本研究を進めるにあたり準備すべき地盤は十分に整っていると判断される。分子実体の特定については、現在までに”主要寄与分子”と呼べる受容体・トランスポーターの決定付けは不十分である。ただし、放射性同位元素標識体を用いた定量的解析や蛍光物質標識体を用いた時空間的解析について実験系の準備は整っており、今後、この分子実体同定に向けた研究は加速するものと期待される。以上の点から、進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度に完成した標識angiopep-2と、新たに確立したinner BRBのin vitro実験系である多細胞性スフェロイドを活用し、BRBを介したangiopep-2認識型CPP輸送機構の実体に迫る研究を中心に遂行する予定である。In vivo網膜へのangiopep-2分布能は125I標識体で試験し、網膜内にて投与後に蓄積する細胞種の特定はFAM標識体で解析する。特に、FAM標識体の網膜内分布特性がGFP標識体のその特性と同一であるかを検証することで、angiopep-2輸送系の高分子送達における重要性をin vivoにて示す計画である。分子実体の特定についてはinner BRBについては前述の多細胞性スフェロイドを用いた解析を中心とし、inner BRBと同様に網膜への薬物分布を制御する外側血液網膜関門 (outer BRB) の実体細胞株であるRPE-J細胞も活用することで、多角的に迫る戦略を立てている。
本解析と並行し、病態時において本CPP輸送機構が網膜への薬物デリバリールートとしての重要性について検証を進める計画である。具体的には、糖尿病時に発症する網膜症に対する治療薬送達への応用を考慮し、ストレプトゾトシンを静脈内に投与することで血糖値上昇を誘発させたラットを用い、本ラットに対するangiopep-2標識体の末梢投与後における網膜分布を解析する。また、angiopep-2輸送に関与することが示唆された分子実体について、本ストレプトゾトシン投与ラット網膜における発現・分布パターンを解析することで、創薬応用の現実性を考察する予定である。
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