Identification of macrotranscytosis based on clarification of the molecular mechanism of transport of tissue barrier penetrating peptides

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H02786
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 伊藤 慎悟 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (20466535)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大槻 純男 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (60323036)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 細胞膜透過ペプチド / 組織関門 / マクロピノサイトーシス / トランスサイトーシス / ドラックデリバリーシステム

Outline of Annual Research Achievements

織透過ペプチドであるDNPペプチドのマクロトランスサイトーシス輸送に関与する分子候補について、レンチウイルスを用いた分子XのノックダウンCaco-2細胞を構築した。Transwellを用いた経細胞輸送実験を行った結果、分子XノックダウンCaco-2細胞においてDNPペプチドの輸送が有意に低下した。昨年度の取り込み実験の結果と統合すると、DNPペプチドは分子Xを介して小腸上皮を透過することが示唆された。In vivoマウスモデルにおいて、抗分子X抗体を用いた阻害実験から、DNPペプチドを用いたインスリンの小腸吸収が抗分子X抗体の存在によって低下し、それによるインスリンの血糖降下作用も低下した。これらの結果から、DNPペプチドの小腸吸収は分子Xを介して行われることが示唆された。
分子Xの知見をもとに、BBB透過環状ペプチドであるSLSペプチドのマクロトランスサイトーシスに関与する分子をBBBプロテオーム解析データから推定したところ、分子Yが候補として挙がった。shRNAを用いて分子Yを安定的にノックダウンしたBBBモデル細胞の構築を行い、この構築した分子YノックダウンBBBモデル細胞を用いてSLSペプチドの輸送解析を行った。その結果、SLSペプチドのBBBモデル細胞への取り込みは有意に低下した。また、分子Yのリコンビナントタンパク質を作成し、SLSペプチドと分子Yの結合実験を定性的に行ったところ、SLSペプチドは分子Yに結合することが確認された。以上の結果から、SLSペプチドの輸送に分子Yが関与することが示唆された。一方で、分子YだけではBBBにおけるSLSペプチドの輸送を説明することは難しいことも判明し、SLSペプチドのマクロトランスサイトーシスの解明には新たな分子を同定することが必要であることも示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

DNPペプチドおよびSLSペプチドの輸送分子を同定できてきていることから、本研究は概ね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、小腸透過環状ペプチドDNP (DNPペプチド) について、(計画3)組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の輸送特性解析と(計画4)　組織関門透過ペプチド輸送分子の発現量・局在解析を実施する。一方、血液脳関門透過環状ペプチドSLS　（SLSペプチド）について、(計画1)　組織関門透過ペプチドの細胞内内在化に関わる分子の探索と　(計画2)　組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の同定を実施する。
具体的には、同定分子が既知のマクロトランスサイトーシスを惹起するかをEIPAを含む既知のマクロトランスサイトーシス阻害剤およびマクロピノサイトーシス解析で汎用される蛍光標識70kDaデキストランの細胞内取り込み実験によって検討する。また、阻害実験から想定されるマクロトランスサイトーシスに関わる分子を遺伝子ノックダウンし、その寄与を解析する。さらに、培養細胞やマウス組織、ヒト組織における同定分子の発現局在を免疫組織化学的解析によって解析し、その発現量を定量プロテオーム解析を用いて行う。一方、血液脳関門透過環状ペプチドSLS　（SLSペプチド）について、(計画1)　組織関門透過ペプチドの細胞内内在化に関わる分子の探索と　(計画2)　組織関門透過ペプチド細胞内内在化分子の同定を実施する。まず、SLSペプドのマクロトランスサイトーシスにおいて細胞内内在化に関わる分子を同定するために、遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーと細胞取り込み解析を組み合わせた同定戦略を実施する。次に、細胞内内在化分子の同定を次世代シークエンサー解析によって実施する。一方で、これまでにSLSペプチドのマクロトランスサイトーシス輸送に関わる分子候補が挙がっており、その分子の関与について発現細胞やノックダウン細胞を構築し、細胞内内在化への関与を解析する。