2022 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanisms that maintain stemness in metastatic colorectal cancer
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22H02909
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
青木 正博 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 副所長兼分野長 (60362464)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三城 恵美 (佐藤恵美) 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任講師 (00455544)
梶野 リエ 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (20633184)
小島 康 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (30464217)
藤下 晃章 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (50511870)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 大腸がん / 転移 / マウスモデル / がん幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸がんに関連する4つの遺伝子（Ctnnb1、Kras、Trp53、 Smad4）の変異を腸管上皮細胞に散発的に導入することによって、腺がんを自然発症して肝臓に転移する、新規転移性大腸がんマウスモデル（CKPSマウス）の作出に成功している。そしてCKPSマウスの解析からcAMP/PKA/CREB-ALCAM経路、およびシグナル経路Xの活性化が大腸がんのがん幹細胞性の維持に関与し、転移形成能を正に制御することを見出している。これらの予備的検討結果に立脚し、令和4年度は以下の研究を実施した。
1. PKA-CREB-ALCAM経路の役割解明: CREBが制御する、大腸がん幹細胞性に関与する遺伝子を同定するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施した。CKPSマウス由来の大腸がん細胞株(CKPS細胞)を、通常（2次元）培養条件とがん幹細胞（3次元）培養条件で培養した後、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施したところ、がん幹細胞培養で増加する配列を約450個、減少する配列を約250個同定することができた。これらの近傍遺伝子リストから、がん幹細胞性およびALCAMの発現調節に関与する遺伝子の候補を絞り込む作業を行っている。
2. シグナル経路Xの役割解明: シグナル経路Xの下流で転移性大腸がんの幹細胞性・転移形成能に関与する分子を同定するため、経路Xの重要な構成因子をコードする遺伝子3つをそれぞれノックアウト（KO）したCKPS細胞、および対照CKPS細胞を用いた脾注肝転移モデルにより肝転移巣を形成させ、それぞれの転移巣組織を回収し、RNA-seq解析を実施した。これまでに、構成因子AをKOした細胞の肝転移巣において分泌に関わる遺伝子などの発現が上昇していることを確認している。現在これらの発現制御機構や転移における役割について解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新しい転移性大腸がんのマウスモデルの作出、およびcAMP/PKA/CREB経路が大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与することについて、Cancer Research誌に論文発表した。また、CREBが大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与するメカニズムを解明するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施し、複数の候補遺伝子を見つけることができた。シグナル経路Xについても、構成因子を個々にノックアウトした大腸がん細胞の肝転移巣を用いたRNA-seq解析を実施し、ノックアウトによって発現が変動する分子を見出すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析の結果を元に、がん幹細胞培養条件下および通常培養条件下において、ChIP-seqで同定したリン酸化CREBの標的遺伝子候補群についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、PKA-CREB経路によるALCAM発現制御機構の解明を目指す。また、個別のリン酸化CREB標的遺伝子候補についても、ALCAMの発現やがん幹細胞性への関与を検討する。関与が示唆される遺伝子やシグナル経路については、CRISPR-Cas9によるノックアウトや阻害化合物を用いた実験により、その役割を検証する。同時に、PKA-CREB経路がALCAM非依存的に大腸がんの幹細胞性維持に関わる可能性についても検討する。また、シグナル経路X構成因子をノックアウトした大腸がん細胞による肝転移巣のRNA-seq解析結果については、in vitroにおける遺伝子発現データと比較しながら、得られた解析結果についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、経路Xの下流で大腸がんの幹細胞性に関与する遺伝子や代謝経路の候補を絞り込む。さらに、TCGAなどの公共データベースや公開されている情報を元にin silicoベースでの解析を行い、ヒト大腸がんにおける候補遺伝子の発現について検討する。その後、大腸がん臨床検体（原発巣・転移巣）を用いた免疫染色やqRT-PCR、ウェスタンブロット等による発現解析によって検証を行う。
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