2022 Fiscal Year Annual Research Report
認知症治療標的としてのミクログリアによるアストロサイト制御機構に剖検脳から迫る
| Project/Area Number |
22H02995
|
|---|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Institution | Niigata University |
|---|
Principal Investigator |
他田 真理 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (30646394)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池内 健 新潟大学, 脳研究所, 教授 (20372469)
竹林 浩秀 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60353439)
加藤 隆弘 九州大学, 医学研究院, 准教授 (70546465)
柿田 明美 新潟大学, 脳研究所, 教授 (80281012)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | microglia / CSF1R / ALSP / snRNA-seq / spatial gene expression |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の特徴は、1) ALSPの患者脳の解析から見出した、恒常性ミクログリアの不足とアストロサイトの過剰反応に着想をえて、ミクログリアとアストロサイトの相互制御機構に着目した点、2) ALSP患者の剖検脳を用いて、単一核遺伝子発現解析と、10×genomics社の最新の手法であるVisium空間的遺伝子発現解析により、網羅的にRNA発現解析を行い、直接的に患者脳における遺伝子発現変化をとらえ、鍵分子を同定する点である。
初年度である昨年度は、剖検脳を用いた単一核遺伝子発現解析（ALSP3例vs対象例3例）および、Visium空間的遺伝子発現解析（fresh frozenとFFPE切片を用いて、ALSP3例vs対象例3例）を行った。どちらの手法も試行前にサンプルのRIN値やDV200値を確認し、RNAの質が保たれているサンプルを用いることで、十分な質のデータを得ることができた。現在、ミクログリアについて両手法から得られたデータを統合し、空間情報を有する遺伝子発現情報としてALSPとコントロールを比較検討している。現在までのところ、ALSPにおけるミクログリアでは、疾患特異的な遺伝子発現を示す群は指摘できず、一方で、組織学的に推測されている様に恒常性ミクログリア遺伝子の発現低下が確認されている。統合により得られたデータの妥当性を検証するために、同一症例の切片を用いて免疫染色を進めており、切片上に反映された統合データの妥当性が概ね確認できている。
初年度で剖検脳を用いたsnRNA-seq及びVisium空間的遺伝子発現解析の実験手法を確立できており、順調に進捗している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度である昨年度は、剖検脳を用いた単一核遺伝子発現解析 （ALSP3例vs対象例3例）および、Visium空間的遺伝子発現解析（fresh frozenとFFPE切片を用いて、ALSP3例vs対象例3例）を行った。どちらの手法も試行前にサンプルのRIN値やDV200値を確認し、RNAの質が保たれているサンプルを用いることで、十分な質のデータを得ることができた。現在、ミクログリアについて両手法から得られたデータを統合し、空間情報を有する遺伝子発現情報としてALSPとコントロールを比較検討している。snRNA-seqのデータと、Visium空間的遺伝子発現解析のデータを統合した結果の妥当性を検証するために、組織切片上で代表的遺伝子について、免疫染色を進め統合された結果の妥当性が概ね確認できた。
初年度で剖検脳を用いたsnRNA-seq及びVisium空間的遺伝子発現解析の実験手法を確立できており、さらに、それら２つの手法で得られたデータを統合することができた。また、得られた結果について組織切片上の免疫染色と比較しある程度の一致を認め、snRNA-seqのデータとVisiumのデータを統合して切片上にミクログリアの遺伝子発現情報を反映することが妥当に行われれたと判断できた。
初年度に本研究計画の中心となる実験手法２つを確立することができたため、順調に進捗していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、まず、昨年度得られたsnRNA-seqのデータと、Visium空間的遺伝子発現解析のデータの解析を進める。ミクログリア以外の中枢神経系構成細胞、アストロサイトやオリゴデンドロサイト、神経細胞、血管内皮について、順次解析を進める。特にアストロサイトについては、「ミクログリアの機能不全によるアストロサイトへの制御機能の破綻がアストロサイトの異常な活性化を惹起し、ミクログリア-アストロサイト連関によって白質変性が加速して進行するのではないか」という本研究の中心をなす問いの主役であり、ミクログリア同様に詳細に解析する。ALSPで発現上昇している遺伝子から、アストロサイトが関連するpro-inflammatoryなpathwayが見出せるかどうかに注目する。また、ミクログリア及びアストロサイトでALSPで発現上昇している遺伝子に注目し、ligand-receptor解析で相関するものがないかどうかも検討する。アストロサイトでALSP特徴的な発現遺伝子が見出せた場合、Visiumのデータと統合して、空間的にミクログリアのそれぞれのクラスターとの位置関係も検討する。免疫染色やin situ hybridizationでデータの妥当性を検証する。
それぞれの細胞でALSPにおける遺伝子発現変化を明らかにし、空間情報に合わせて解析することで病態の中核をなす遺伝子を絞り込む。最終的には、患者由来のiMG細胞やミクログリアが減少するモデルマウスを用いて病態への関与の有無を検証する。
|
| Remarks |
新潟大学脳研究所脳研究所ホームページ、研究成果・実績欄
|
