2022 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidating the transcriptional network for profibrotic secretome and its application for heart failure therapy
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22H03071
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
星野 温 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50737210)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 線維化 / セクレトーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NRF2の線維化関連遺伝子発現調節機構の解明のため、NRF2転写複合体の解析をBioID（近位依存性ビオチン標識）にて行った。BioIDはNRF2-TurboIDノックイン細胞、Smad4-TurboIDノックイン細胞をそれぞれCRISPRによるゲノム編集にて作成し生理的タンパク質発現レベルでのタンパク質複合体評価を実施した。その結果、corepressorとして知られるDDX54がNRF2の線維化関連遺伝子発現抑制に関与していることが示唆された。マウスモデルでの評価は、Keap1-floxマウスをPostn-MerCreMerマウスと掛け合わせた薬剤誘導性・線維芽細胞特異的Keaplノックアウトマウスを用いて、圧負荷心不全モデルにおいて心臓線維化の評価を行った。８週齢マウスにタモキシフェンを腹腔内投与し、９週齢で横行大動脈縮窄術を施行し１３週齢で評価を行った。Keap1ノックアウトで有意な線維化抑制を確認するとともに心肥大の抑制も確認できた。また腎臓の線維化に関しても片側尿細管結紮モデルで評価したところ、こちらも間質線維化の抑制を確認できた。中分子ペプチドに関しては10mM程度の高容量ではNRF2活性化作用が確認できたが、細胞内への移行が簡単ではなくTATペプチドを結合したり、脂質粒子での細胞内取り込みを向上を施したが低用量での活性化が難しいため低分子化合物での評価を進める方針とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NRF2の線維化関連遺伝子発現抑制機構の解明として転写複合体の解明を完了し、マウス線維化モデルにおいてもKeap1ノックアウトによる抗線維化作用が確認できたため順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
NRF2が線維化関連遺伝子の転写抑制を行うにあたり昨年度に実施したBiioIDからDDX54がコリプレッサーとしてはたらいていることが示唆された。そのため、まずはNRF2がDDX54とタンパク結合を有するかを免疫沈降にて確認するともに、DDX54欠損細胞で線維化関連遺伝子の転写抑制がキャンセルされるかを確認する。NRF2ノックアウトによる心臓線維化抑制はOpstn-MerCreMerマウスを用いたタモキシフェン誘導活性化線維芽細胞特異的ノックアウトマウスで確認された。これに対して心筋細胞特異的ノックアウトでどうなるかをMyh6-MerCreMerマウスを用いて評価する。また評価を行っている圧負荷心不全モデルの活性化線維芽細胞におけるNRF2発現の評価に取り組む。NRF2はタンパク分解で調節されるため、mRNAによる評価が難しいため、ROSA td-TOMATO x Opstn-MerCreMerにてtd-TOMATOの細胞ソーティングで線維芽細胞を回収し、NRF2の染色やWBで定評評価を試みる。NRF2活性化中分子ペプチドは候補ペプチドの細胞内への移行がやはり困難であり、方針を低分子化合物に切り替えることとした。こちらに関しては既にベンチャー企業が保有しているものを用いて共同研究に切り替えて抗線維化作用を評価する。
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Research Products
(1 results)
