2023 Fiscal Year Annual Research Report

変形性関節症に対する間葉系間質細胞由来セクレトーム治療における作用機序の解明

Research Project

Project/Area Number	22H03201
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	中村憲正大阪大学, 国際医工情報センター, 招へい教授 (50273719)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	落谷孝広東京医科大学, 医学部, 特任教授 (60192530) 吉岡祐亮 (吉岡祐亮) 東京医科大学, 医学部, 講師(特任) (60721503) 辻井聡大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任講師(常勤) (70898014)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Keywords	セクレトーム / 間葉系幹細胞 / miRNA / バイオインフォマティクス解析 / 組織修復
Outline of Annual Research Achievements	間葉系間質細胞(Mesenchymal stromal cell:MSC)による組織治療効果は抗炎症作用、マトリックス形成、破壊などを制御するTrophic作用によるものとされるが、近年MSCが産生するエクソソームを主体とする細胞外小胞群であるセクレトーム(Secretome:SCR)の関与が報告されている。 MSC由来SCR（MSC-SCR）による組織治療の臨床応用に向けては、安全で効率良い調製法に加え、レギュラトリーサイエンスの観点から製品規格の確立、特にSCRの作用機序(Mode of Action:MOA)の同定が鍵となる。その候補としてSCRには遺伝子発現の制御に重要な役割持つとされるマイクロRNA(microRNA:miRNA)が豊富に含まれ、SCR治療メカニズムの鍵となる因子として注目を集めているが、組織治療におけるmiRNAを介した病態制御の系統的メカニズムの詳細は不明である。そこで本研究では標的細胞へのSCR投与に伴う変動遺伝子を網羅的に解析し、SCRのmiRNAを介した病態制御のMOAを解明するため、肩腱板断裂モデルラットを用いて、IFN-γでpre-conditioningされたMSC-SCRが骨ー腱修復に与える影響を検討する上で、本年度に以下の成果を得た。通常条件で回収したMSC-SCRは、LPS刺激を加えたマクロファージ様細胞株に対して、炎症性のサイトカインの分泌を減少させ、関連する遺伝子発現も抑制した。また、in vivo実験を行うにあたって、ラットを用いた肩腱板断裂モデルの作成とその修復法について検討する予備実験を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究課題を進めていくにあたって、MSC培養中のpre-conditioning刺激条件を選定することが非常に重要であるが、すでに条件検討は終了し、今後の実験へのスムーズな応用が期待される。in vivo、in vitroともに最終目標に向けて着実に進展していると考える。今後は、通常培養で得られるNormal-MSC-SCR(N-MSC-SCR)と選定した刺激条件下で得られるPre-conditioning-MSC-SCR(P-MSC-SCR)を用いた比較実験にて効果検証を遂行する予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究予定として， MSC-SCRの変性疾患におけるターゲット細胞を培養し、MSC-SCR添加後の細胞内遺伝子発現プロファイルを網羅的にRNA-seqを用いて同定するにあたり、ラット腱板断裂モデルを用いたMSC-SCR投与実験を行う予定である。 3ヶ月齢のオスSprague-Dawley(SD)ラットの棘上筋の遠位部を切離し、腱板を断裂させ、4週後に縫合糸を用いて棘上筋腱を上腕骨付着部に縫着し修復する。再建後より1週毎にN-MSC-SCRを関節内投与し、術後早期である再建後2週、4週時に組織学的解析、および免疫組織化学染色や蛍光免疫染色を行い、修復組織の経時的な変化が十分確認できるか検討を行う。さらに、上記で得られた結果をもとに、同様の手法にて、N-MSC-SCRまたはINF-γでPre-conditioningされたP-MSC-SCRを投与し、修復組織の質を組織学的解析または免疫組織化学染色にて比較し、P-MSC-SCRの有効性を明らかとする予定である。また、in vitro実験において、修復過程で関与する細胞への治療効果も評価する予定である。さらに，MSC-SCRの内包するmiRNAとターゲット細胞中の変動遺伝子を網羅的に解析し、病態制御に係わる遺伝子群やSCR中のmiRNA群のネットワークをBioinformatic解析により同定し、修復に関与する重要な因子の探索を進め、SCRのmiRNAを介した病態制御のMOAを解明していく予定である。上記研究は複数（5検体）ドナーより調製したMSC-SCRに対して行い、SCRの個体差について検討する。また研究が予想を上回る速度で進捗した場合、滑膜MSC由来のSCRのMOA解析も追加し、脂肪MSC由来SCRとの比較検討を行う。