2022 Fiscal Year Annual Research Report
光刺激人工内耳が加速させる細胞移植と分化転換からの蝸牛神経再生による新規難聴治療
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22H03239
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
西村 幸司 帝京大学, 医学部, 講師 (20405765)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
扇田 秀章 滋賀県立総合病院(研究所), その他部局等, 専門研究員 (20761274)
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50397634)
伊藤 壽一 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90176339)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 蝸牛神経 / 細胞移植 / 分化転換 / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、(1)ヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞)から誘導した蝸牛神経前駆細胞を、蝸牛神経を障害した難聴モデル動物の内耳(蝸牛)に移植することに より、蝸牛神経を再生させ、聴覚が回復するかを検証する。(2)人工内耳から蝸牛神経を刺激するのに、電気刺激の代わりに光刺激を用いる新たな人工内耳を作製し、動物に対する有効性の検討を行う。(3)ヒトiPS細胞の移植で再生した蝸牛神経を有する難聴動物に対し、光刺激人工内耳を使用し、その有効性(難聴の回復)を検証する。 Thy1-ChR2-YFPマウスをB/6マウスと交差しヘテロマウスを得た。ヘテロマウス同士の交差で生まれた仔をジェノタイプし、ホモマウスを判別した。1-30 Hzのレーザー光を中耳を開放したThy1-ChR2-YFPマウスの蝸牛外から照射し、光刺激により惹起された波形を得た。蝸牛神経の反応による波形か否かを検証する目的で、ウアバインを後半規管から内耳に局所投与し１型ラセン神経節細胞を化学焼灼した、蝸牛神経障害モデル動物を用いて同様の実験を行った（n = 2)。１匹においては蝸牛外からの光刺激による反応は完全に消失したが、１匹においては刺激終了後から2 ms後にピークがある波形を認め、蝸牛神経以外の反応を記録したと推察された。高度難聴患者の病態を模した難聴モデル動物を作製した。本研究では、2種類の難聴モデル動物を作製した。①蝸牛有毛細胞と蝸牛神経両者の障害モデル動物。②蝸牛神経のみを障害し、蝸牛有毛細胞はほぼ正常に保たれる難聴モデル動物。実験動物にはモルモットを使用した。①には佳菜マイシン、フロセミドの全身投与を行った。②にはNa/K-ATPase阻害剤であるジゴシンの蝸牛内直接投与を行った。①、②とも比較的安定した障害モデルを作製できた。移植細胞ソースの蝸牛神経前駆細胞をヒトiPS細胞から誘導した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
移植細胞ソースの蝸牛神経前駆細胞をヒトiPS細胞から誘導した。すなわち、GFP-hiPSCから既存の分化誘導法(Ishikawa et al., 2017, J of TERM)を用いてNSCを誘導し、10000000 cell/mlの濃度に調整したものを1回の移植に500 μL以上準備した。光刺激による聴性脳幹反応の条件検討を行い、蝸牛への光刺激による反応を得た。聴覚刺激に起因する反応か否かを検証するために、蝸牛神経を障害したモデルを用いて光刺激を行った。蝸牛有毛細胞が障害されるモデル動物と、蝸牛神経が障害されるモデル動物を作製し得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
光感受性遺伝子として、470 nm付近にピークをもつChR2と、500 nm付近にピークをもつChronosの２種類を使用する予定である。光刺激の出力を高く保つためにLEDではなく、レーザーを光源として使用する。レーザーにカニューラを装着し、より細経のファイバー(200-300 μm）を蝸牛内に挿入し、直接蝸牛軸を光照射する。使用動物はマウスとモルモットを用い、双方のoABRの波形特性を記録する。ヒトiPS細胞由来の神経前駆細胞を蝸牛軸に移植し、生着と神経分化、および聴覚の機能回復を検証する。in vitroでAAVによりChR2を神経前駆細胞に発現させ、蝸牛神経障害モデルに神経前駆細胞の細胞移植を行う。聴覚機能の回復は光刺激によるABR反応で検証し、蝸牛の組織解析を行う。
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