2023 Fiscal Year Annual Research Report
光刺激人工内耳が加速させる細胞移植と分化転換からの蝸牛神経再生による新規難聴治療
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22H03239
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
西村 幸司 京都大学, 医学研究科, 講師 (20405765)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
扇田 秀章 滋賀県立総合病院(臨床研究センター), その他部局等, 専門研究員 (20761274)
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50397634)
伊藤 壽一 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90176339)
小野 宗範 金沢医科大学, 医学部, 教授 (30422942)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | ラセン神経節 / 光遺伝学 / アデノ随伴ウイルス / 聴性脳幹誘発反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
京都大学においてThy1-ChR2-YFPホモマウスをを維持、繁殖させた。光刺激による聴性脳幹反応を以下の方法で測定した。8週齢Thy1-ChR2-YFPホモマウスオスを音刺激による聴性脳幹誘発反応を測定して、聴力が正常であることを確認した後、左耳後切開によりブラを開放し蝸牛を露出させた。470 nMのLED光10 mWを蝸牛骨壁に当てて10 Hzで光刺激をおこなったところ振幅約４００ uVの波形が得られ、既報(Hernandez et al., 2014)の光刺激による聴性脳幹誘発反応(oABR)の波形と酷似していた。蝸牛神経刺激特異的な波形か否か検証すべく、蝸牛神経を特異的に障害する薬物（ウアバイン 1 mM)を左後半規管から1 uL局所投与を行い1週後にoABRを測定したところ、波形に変化は全く見られなかった。また、刺激周期に合わせて顔面痙攣を認めた。したがって得られた波形は蝸牛神経特異的な刺激による波形ではなく、筋電図が混入していると結論した。顔面神経がなぜ刺激されたかに関して今後の検証を要する。神経反射経路として、蝸牛近傍を走行している鼓膜張筋は三叉神経により支配されているが、三叉神経から顔面神経核への入力を介して顔面神経が刺激された可能性を考察している。並行して、蝸牛の神経細胞およびグリア細胞にアデノ随伴ウイルスを感染させる実験をおこなった。AAV9-CAG-ChR2-mCherryベクターを生後１日齢ラセン神経節の器官培養に感染させたところ、非神経細胞での遺伝子発現を確認した。また、AAV9-hSyn-ChETA-YFPベクターを生後１日齢ラセン神経節の器官培養に感染させたところ、神経細胞特異的にChETA-YFPを発現した。 in vivoではChETA-YFPは神経細胞体での発現は明らかでなかったが、有毛細胞へ接続する樹状突起での弱い発現を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
光刺激による聴性脳幹誘発反応(oABR)を蝸牛神経再生のツールとして利用すべく、既報（Hernandez et al., 2014)の追試を行ったが、既報の科学的妥当性に疑義が生じ、確認作業に手間を要しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
筋電図の影響を排除して聴覚反応を測定すべく、下丘からシングルチャネルを用いて局所電場電位を測定する系を分担研究者の小野が樹立した。マウス下丘から音刺激による局所電場電位を測定可能となったために、今後、光刺激による下丘からの局所電場電位の測定を予定している。また、神経細胞全体にubiquitousにChR2を発現するThy1-ChR2-YFPマウスではなく、感覚神経細胞にのみChR2を発現するマウスを用いて、oABRの測定を試みる。具体的には分担研究者の小野が所持するVglut2-creマウスのラセン神経節には高いCreの発現を確認できているので、運動神経にCreの発現がないことを確認した上でVglut2-cre; Ai32マウス（Vglut2発現細胞にChR2が発現するマウス）を用いて、oABRおよび下丘からの局所電場電位を測定する。ラセン神経節のグリア細胞特異的に感染するアデノ随伴ウイルスの血清型、プロモーターを選別する。有毛細胞障害後の蝸牛神経のサブタイプ分布に変化が生じるか検証する。具体的にはPou4f1, Lypd-1などのLow-SR神経特異的なマーカーが知られているが、In situ hybridization, 免疫組織化学、定量的PCR法によりコントロール群と蝸牛有毛細胞障害群で、神経サブタイプの二次性変化を比較検討する。ヒトiPS細胞から誘導した神経前駆細胞にAAV9-hSyn-ChETA-YFPベクターを発現し、蝸牛神経障害モデルマウス内耳に細胞移植を行い、蝸牛組織、聴覚機能解析を行う。
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