2022 Fiscal Year Annual Research Report

Epigenetic regulation of multipotency in salivary gland stem cells

Research Project

Project/Area Number	22H03264
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Showa University
Principal Investigator	美島健二昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石田尚子昭和大学, 歯学部, 助教 (00882531) 安原理佳昭和大学, 歯学部, 講師 (20453649) 大庭伸介大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20466733) 田中準一昭和大学, 歯学部, 講師 (40710166) 渡辺貴志国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 技師 (50406815) 馬渕洋順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任准教授 (50424172) 行森茜昭和大学, 歯学部, 助教 (60813748) 阪井丘芳大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (90379082) 鯨岡聡子昭和大学, 歯学部, 助教 (90824673)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	唾液腺 / エピジェネティック制御 / 幹細胞 / 多分化能
Outline of Annual Research Achievements	当該研究で利用する解析システムはChromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムである。本システムの特徴は、細胞から単離した核からDNA およびRNAを抽出し、DNA はscATACseq にRNA はscRNAseq解析にそれぞれ利用される。一方、10xGENOMICSはこれまでMultiome解析に必要な基盤技術を報告しているが、唾液腺組織に関する核単離方法に関する詳細な報告はなされていない。そこで、当該年度では、Chromium Nuclei Isolation Kit（10xGENOMICS）のプロトコールを基本に、胎生期唾液線から解析に必要なQualityの核単離条件を検討した。まず、本システムで最低必要となる細胞数1,000,000細胞を採取するために必要な胎生期マウスの必要数を検討した。すなわち、胎生13.5日の胎仔マウスから両側の顎下腺を摘出し、摘出した唾液腺をヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理後、Trypleにて細胞を分散化し細胞数を計測した。その結果、唾液腺あたり約100,000細胞の採取が可能なことが明らかとなった。当該研究で必要とされる胎生16日および生後8週齢マウスの唾液腺から採取できる細胞数も同様にカウントし、胎生13.5日唾液腺は、妊娠マウス2腹、胎生16日唾液腺は1腹、および生後8週齢のマウスは1匹となることが明らかとなった。次に、これらのマウスより唾液腺をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結し180℃の冷蔵庫で保存した。さらに、Chromium Nuclei Isolation Kitを用いて核を単離し、細胞数のカウントと位相差顕微鏡を用いて単離核のQuality を評価する事により核抽出の条件を検討し、その再現性について確認している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムを用いた唾液腺の解析は、初めての試みで有り、至適条件の検討に時間を要しているため。
Strategy for Future Research Activity	Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC+Gene Expression Reagents（10xGENOMICS）システムを用いて胎生13.5日齢、胎生16日齢および生後8週齢のマウス顎下腺のエピゲノム（scATACseq）および遺伝子発現（scRNAseq）をシングルセルレベルで解析する。加えて、scATACseqおよびscRNAseq解析結果から擬似時系列解析により、各クラスタ間の時間的順序を予測し、細胞分化の方向性を決定する。この際、胎生13.5日, 胎生16日および生後8週のUMAP plotを重ね合わせ、細胞系譜の3系統、2系統ないし1系統のみに分化能を示す細胞クラスター間の発現遺伝子を比較し、多分化能の維持に関与する候補となる転写因子を同定する。さらに、同定された転写因子の機能を唾液腺オルガノイドを用いて解析する