2023 Fiscal Year Annual Research Report
定量プロテオミクスが紐解く新規タンパク質複合体によるHPV陽性癌の新たな病因論
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22H03289
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
常松 貴明 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (70726752)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 治孝 徳島大学, 先端酵素学研究所, 助教 (60709567)
北村 直也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (70351921)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | HPV陽性癌 / 脱ユビキチン化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HPV陽性扁平上皮癌は子宮頸部では90% 以上、頭頸部癌では10% 程度を占める重要な扁平上皮癌の亜型である。近年、子宮頸癌ワクチンとしてHPV ワクチンが開発されたことで、欧米では発症率が大幅に減少したものの、本邦では副反応が問題となり、依然として発生率の高い癌の一つである。そのため、特異的な分子標的治療法の開発は臨床上の重要な課題である。 本研究では、研究代表者らが見出したHPVウイルスタンパク質であるE6、E7からなる新規タンパク質複合体の性状を最新の定量プロテオミクスを用いて解析し、HPV陽性扁平上皮癌の分子標的治療の分子基盤の確立を目指す。これまでに脱ユビキチン化酵素MPNDはE6やE7と結合し、複合体を形成することを見出しており、この新規複合体の相互作用タンパク質の同定を試みた。しかしながら有意な結果を得ることができなかった。問題点としては①MPNDの免疫沈降に使用可能な抗体が存在しない、②過剰発現系を用いると非特異的なシグナルが上昇してしまう、ことが挙げられた。問題点を解決するため、今年度は染色体上のMPND遺伝子座に3xFlagタグを挿入し、内在性のMPNDをFlag標識することに成功した。次年度以降、このシステムを用いて内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。口腔がん臨床サンプルにおけるMPNDの関連の解析に関しては、複数の市販抗体、受託にて作成した抗体(2社)を用いて、条件検討を行ったものの、陽性所見を得ることができなかった。近年、MPNDがDNA m6A修飾を認識するドメインを有することが報告された。そこで、HPV陰性、陽性がん細胞株でm6Aを定量したところ、HPV陽性がんで上昇することを新たに見出した。次年度以降、MPNDの代わりにm6Aの抗体を用いて臨床サンプルの解析や分子機構の解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
着目する脱ユビキチン化酵素MPNDに対する複数の市販抗体がMPNDを検出することができなかったため、前年度2社でそれぞれ異なる抗原ペプチドを用いて受託にて抗体作成を行った。本年度、これらの2種類の抗体を用いて検討を行ったものの、MPNDを検出することができなかった。以上によりやや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、前述の本年度樹立に成功した内在性MPNDが3xFlag標識された細胞株を用いて、内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。また、本年度新たにHPV感染とDNAのm6A修飾の関連性を明らかにしたことから、次年度以降に口腔がん臨床サンプルにおけるHPV感染とDNA m6Aの関連の解析を抗m6A抗体を用いて、進める。さらに、MPND複合体とDNA m6Aの相互作用による分子機構に関してもDNA m6Aのメチル化酵素であるN6AMT1や脱メチル化酵素ALKBH1,4に対するshRNAなどを用いて、主に培養細胞株で検討する。また、これまでの研究結果より、MPNDはE6及びE7非存在下では細胞質に局在し、E6及びE7存在下では核内にも集積することを見出しており、前述の内在性にMPNDがFlag 標識された細胞株を用いて、細胞内局在変化に関しても詳細な検討を加える。
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