高機能等温核酸増幅酵素の創製と構造解析および病原体の現場での迅速検出への応用

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22H03332
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 保川 清 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助教 (70263126) ; 藤原 伸介 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90263219) ; 柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 部長 (60314415) ; 吉宗 一晃 日本大学, 生産工学部, 教授 (50325700) ; 兒島 憲二 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (40542759)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 等温核酸増幅法 / リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法 / ピルビン酸キナーゼ / 鎖置換DNAポリメラーゼ / uvsY

Outline of Annual Research Achievements

①好熱性のAREであるThermotoga maritimaピルビン酸キナーゼを使用したRPA凍結乾燥試薬は、rCKまたはヒトピルビン酸キナーゼを使用したそれよりも、室温でより長期間の保存安定性を有した。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。H1-Polを使用したRPA凍結乾燥試薬は、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（BstPol）あるいはC1-Polを使用したそれよりも、室温で、より長期間の保存安定性を有した。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、最も溶解性の高い変異A116Hを選抜した。従来、RPAの凍結乾燥試薬の調製には溶解度の低いuvsYは不溶化を防ぐため、他の酵素類とは異なり、グリセロール除去のためのゲルろ過にかけられず、凍結乾燥直前に加えていた。しかしA116Hを用いることにより、ゲルろ過にかけることが可能となった。④T4ファージ由来ヘリカーゼgp41は一本鎖DNA存在下でATPase活性を有した。RPA反応液にmolecular crowding剤として添加されているPEG35000の濃度の増大に伴い、gp41の酵素活性も増大した。RPA試薬にgp41を添加すると、反応効率が向上した。⑤gp32がdsDNAと結合すると抗gp32抗体との反応性が大幅に低下することを見出した。抗gp32抗体を用いたペーパーイムノクロマトグラフィーは、PCR反応によって生成するdsDNAには反応せず、消費されるプライマーの減少を検出できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

等温核酸増幅法は病原体の現場での迅速な検出に好ましいが、使用するタンパク質・酵素が不安定なため試薬の冷凍保存が必要である。コロナパンデミック社会を迎え、環境を対象とした病原体検査が公衆衛生上喫緊の課題となり、試薬の常温保存が求められている。申請者らはこれまでに、耐熱型逆転写酵素と高活性DNAポリメラーゼを開発し、これらを用いて新型コロナウイルスのRT-PCRを開発した。本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取
得し、活性と安定性を比較することを目的としている。2024年度は、好熱性細菌であるThermotoga maritima由来の好熱性AREであるピルビン酸キナーゼ、好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) 由来の好熱性PolであるH1-Pol、中温性のRecであるuvsYの変異体であるA116H、T4ファージ由来ヘリカーゼであるgp41に関して成果を上げた。

Strategy for Future Research Activity

等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）は、PCRと異なり温度の上げ下げが不要なため、後進国あるいは現場での病原体の検出に最適と注目されている。これを実現させるためには、室温での試薬保存を可能とする安定な酵素が必要である。本研究では、従来RPA法で使用されてきたATP再生酵素とDNAポリメラーゼを好熱性の新規な酵素に代替することにより、凍結乾燥試薬の室温での長期保存を可能とした。今後、ドイツの１企業と共同で、本成果をもとに社会実装に向けたRPA試薬の開発を行う。

Research Products

• [Journal Article] Leu606 of human DNA polymerase δ plays a role in discriminating deoxyribonucleotide and ribonucleotide (2025)
  • Author(s): Ueno, R., Ishibashi, S., Kandabashi, M., Fukata, K., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Biol. Macromol. Volume: 25 Pages: 3-13
  • DOI: 10.14533/jbm.25.3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Expression of recombinant human α-glucosidase in HEK293 cells (2025)
  • Author(s): Nishimoto, S., Debarbat, A., Ikeda, Y., Arikawa, E., Odagaki, Y., Yano, H., Qiao, Y., Ito, M., Kimura, T., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: J. Agric. Food Chem. Volume: 73 Pages: 617-624
  • DOI: 10.1021/acs.jafc.4c06902
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure-function analysis of Streptomyces griseolus CYP105A1 in the metabolism of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (2025)
  • Author(s): Takita, T., Wada, M., Yamagata, M., Kamata, S., Mizutani, K., Yogo, Y., Hamada, M., Yasuda, K., Mikami, B., Sakaki, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 64 Pages: 468-478
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.4c00652
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A unique structure of bacteriophage T4 gene 32 protein with double-stranded DNA in low-salt conditions is distinguished by antibodies (2025)
  • Author(s): Yasuda, M., Pham, N.T.K, Hirakawa, Y., Momma, K., Takita, T., Tsuboi, M., Yasukawa, K., and Yoshimune, K.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1093/bbb/zbaf009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression in HEK293 cells, purification, and characterization of recombinant human α-glucosidase (2025)
  • Author(s): Nishimoto, S., Takita, T., Nishida, K.M., Ito, M., Kimura, T., Kimura, Y., Kioka, N., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 89 Pages: 990-994
  • DOI: 10.1093/bbb/zbaf055
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Adenosine triphosphate induces amorphous aggregation of amyloid β by increasing Aβ dynamics (2024)
  • Author(s): Kuramochi, M., Nakamura, M., Takahashi, H., Komoriya, T., Takita, T., Pham, N.T.K., Yasukawa, K., and Yoshimune, K
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 14 Pages: 8134
  • DOI: 10.1038/s41598-024-58773-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enhanced stability of lyophilized reagent of recombinase polymerase amplification using a thermostable pyruvate kinase from Thermotoga maritima (2024)
  • Author(s): Juma, K.M., Murakami, Y., Morimoto, K., Takita, T., Kojima, K., Suzuki, K., Yanagihara, I., Fujiwara, S., and Yasukawa, K
  • Journal Title: J. Biosci. Bioeng. Volume: 138 Pages: 29-35
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2024.04.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Use of human Caco-2 cells and HPAE-PAD for α-glucosidase assay (2024)
  • Author(s): Ikeda, Y., Nishimoto, S., Qiao, Y., Yano, H., Minami, H., Ito, M., Kimura, T., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Pharmacol. Toxicol. Methods Volume: 127 Pages: 107508
  • DOI: 10.1016/j.vascn.2024.107508
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of ribonuclease H2 A subunit (RH2A)-knockout HEK293 cells and analysis of the ribonucleotide content of their genomic DNA (2024)
  • Author(s): Yano, H., Nishimoto, S., Kandabashi, M., Ogawa, S., Matsumoto, K., Hara, H., Baba, M., Takita, T., and Yasukawa, K.:
  • Journal Title: J. Biol. Macromol. Volume: 24 Pages: 33-45
  • DOI: 10.14533/jbm.24.33
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of an endonuclease and N6-adenine methyltransferase from Ureaplasma parvum SV3F4 strain (2024)
  • Author(s): Wu, H.N., Fujisawa, Y., Tozuka, Z., Fomenkov, A., Nakura, Y., Kajiyama, S., Fujiwara, S., Yasukawa, K., Roberts, R.J., and Yanagihara, I
  • Journal Title: Enzyme Microb. Technol. Volume: 180 Pages: 110471
  • DOI: 10.1016/j.enzmictec.2024.110471
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Unveiling the reaction mechanism of arginine decarboxylase in Aspergillus oryzae: Insights from crystal structure analysis (2024)
  • Author(s): Odagaki, Y., Murakami, Y., Takita, T., Mizutani, K., Mikami, B., Fujiwara, S., and Yasukawa, K.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 733 Pages: 15028
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2024.150728
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒトDNAポリメラーゼδのLeu606への変異導入がDNAへのリボヌクレオチド取り込みに与える影響 (2025)
  • Author(s): 上野凜、石橋周侑、神田橋眞子、深田健太郎、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第534回講演会
• [Presentation] 放線菌由来シトクロムP450を用いた医薬品代謝物の製造 (2025)
  • Author(s): 米田幸世、安田佳織、今石浩正、滝田禎亮、三上文三、保川清、榊利之、生城真一
  • Organizer: 日本薬学会第145年会
• [Presentation] 等温核酸増幅法RPAへの利用に向けたT4ファージ由来ヘリカーゼgp41およびDNAポリメラーゼgp43の調製および性状解析 (2025)
  • Author(s): 亀川竜暉、天野晴貴、森脇航、山本紗希、西村崇志、滝田禎亮、柳原格、藤原伸介、保川清、古庄仰、兒島憲二、轟木堅一郎
  • Organizer: 日本薬学会第145年会
• [Presentation] 抗体との反応性に基づいた一本鎖DNA結合タンパク質gp32 の二本鎖DNA結合による構造変化の評価 (2025)
  • Author(s): 安田弥奈，Pham Ngan Thi Kim，平川由紀，門間敬子，滝田禎亮，坪井誠，保川清，吉宗一晃
  • Organizer: 日本農芸化学会2025年度大会
• [Presentation] 組換えヒトα-グルコシダーゼのHEK293細胞への発現 (2024)
  • Author(s): 西本創、Anais Debarbat、池田祐輝、有川慧美、小田垣祐生、矢野晴菜、喬穎、伊東昌章、木村俊之、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第531回講演会
• [Presentation] Thermotoga maritimaピルビン酸キナーゼ使用によるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法凍結乾燥試薬の保存安定性の向上 (2024)
  • Author(s): Kevin Maafu Juma、村上雄人、森本健太、滝田禎亮、兒島憲二、鈴木孝一朗、柳原格、生田宗一郎、藤原伸介、保川清
  • Organizer: 日本生物高分子学会2024年度大会
• [Presentation] Expression of recombinant human α-glucosidase in HEK293 cells (2024)
  • Author(s): So Nishimoto, Anais Debarbat, Yuki Ikeda, Emi Arikawa, Yuki Odagaki, Haruna Yano, Ying Qiao, Masaaki Ito, Toshiyuki Kimura, Teisuke Takita, and Kiyoshi Yasukawa
  • Organizer: 日本生物高分子学会2024年度大会
• [Presentation] DNA結合タンパク質gp32のDNA結合による構造変化に対する塩濃度の影響 (2024)
  • Author(s): 安田弥奈、Ngan Thi Kim Pham、平川由紀、滝田禎亮、門間敬子、保川清、吉宗一晃
  • Organizer: 日本生物高分子学会2024年度大会
• [Presentation] Thermococcus kodakarensis 由来の2種類の耐熱性ヘリカーゼを利用したヘリカーゼ依存型DNA増幅法の試み (2024)
  • Author(s): 高田朱理、西晃輝、村上雄人、鈴木孝一朗、柳原格、保川清、藤原 伸介
  • Organizer: 第76回日本生物工学会大会
• [Presentation] Aeribacillus pallidus H1由来鎖置換型DNAポリメラーゼの安定化 (2024)
  • Author(s): 西晃輝、高田朱理、柳原格、名倉由起子、保川清、藤原伸介
  • Organizer: 第76回日本生物工学会大会
• [Presentation] Leu606 of human DNA polymerase δ plays a role in discriminating deoxyribonucleotide and ribonucleotide (2024)
  • Author(s): Rin Ueno, Shu Ishibashi, Mako Kandabashi, Kentaro Fukata, Teisuke Takita, and Kiyoshi Yasukawa
  • Organizer: RNaseH2024
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒトDNAポリメラーゼδのLeu606のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの識別における役割 (2024)
  • Author(s): 上野凜、石橋周侑、神田橋眞子、深田健太郎、滝田禎亮、保川清
  • Organizer: 2024年度日本農芸化学会関西支部大会（第532回講演会）
• [Presentation] Unveiling the reaction mechanism of arginine decarboxylase in Aspergillus oryzae: Insights from crystal structure analysis (2024)
  • Author(s): Yuki Odagaki, Yui Murakami, Teisuke Takita, Kimihiko Mizutani, Bunzo Mikami, Shinsuke Fujiwara, Kiyoshi Yasukawa
  • Organizer: 国際ポリアミン会議
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Aspergillus oryzae アルギニンデカルボキシラーゼの触媒機構の推察 (2024)
  • Author(s): 小田垣祐生、村上優衣、前川和葉、滝田禎亮、水谷公彦、三上文三、藤原伸介、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第533回講演会
• [Presentation] 細菌性コラゲナーゼの基礎と応用に関する研究 (2024)
  • Author(s): 保川清
  • Organizer: ビタミンB研究委員会 2023年度シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Thermotoga maritimaピルビン酸キナーゼ使用によるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法凍結乾燥試薬の保存安定性の向上 (2024)
  • Author(s): Kevin Maafu Juma、村上雄人、森本健太、滝田禎亮、兒島憲二、鈴木孝一朗、柳原格、生田宗一郎、藤原伸介、保川清
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第530回講演会 2024年