Development and structural analysis of high-performance isothermal nucleic acid amplification enzymes and their application for rapid pathogen detection in the field

2024 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 23K24590
• Project/Area Number (Other): 22H03332 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 58020:Hygiene and public health-related: including laboratory approach
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: Yasukawa Kiyoshi 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 兒島 憲二 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (40542759) ; 吉宗 一晃 日本大学, 生産工学部, 教授 (50325700) ; 柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 部長 (60314415) ; 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助教 (70263126) ; 藤原 伸介 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90263219)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 等温核酸増幅法 / リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法 / ピルビン酸キナーゼ / 鎖置換DNAポリメラーゼ / リコンビナーゼ / uvsY

Outline of Final Research Achievements

The objective was to develop enzymes used in the recombinase polymerase amplification method (RPA). The freeze-dried reagent using the thermophilic ATP regeneration enzyme Thermotoga maritima pyruvate kinase had longer storage stability than the conventional rabbit creatine kinase. The freeze-dried reagent using DNA polymerase (Pol) from the thermophilic bacterium Aeribacillus pallidus exhibited longer storage stability than that using Pol from the conventional Bacillus stearothermophilus. A library was created to increase the solubility of the recombinase uvsY, and soluble variants were selected.

Free Research Field

タンパク質工学

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）は、PCRと異なり温度の上げ下げが不要なため、後進国あるいは現場での病原体の検出に最適と注目されている。これを実現させるためには、室温での試薬保存を可能とする安定な酵素が必要である。本研究では、従来RPA法で使用されてきたATP再生酵素とDNAポリメラーゼを好熱性の新規な酵素に代替することにより、凍結乾燥試薬の室温での長期保存を可能とした。今後、ドイツの１企業が、本成果をもとに社会実装に向けたRPA試薬の開発を行う。