2022 Fiscal Year Annual Research Report
Can a combination of cofactor-binding prediction and experimental validation identify uncharacterized enzymes?
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22H03690
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
塩生 真史 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (30345847)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
向 由起夫 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (60252615)
中村 卓 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (80344050)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 機能アノテーション / 機械学習 / 結合アッセイ / メタボローム解析 / X線結晶構造解析 / 出芽酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、様々な生物種に多数存在する機能未知タンパク質の中から、特に未同定の酵素を明らかにすることを目的とし、酵素活性に必要な補因子の結合予測モデルの構築、および、結合予測モデルによって検出したタンパク質について、出芽酵母を実験モデルとした結合および細胞内代謝への関与を確認する実験を実施することを計画している。2022年度は、以下のことを行った。
1. これまでに結合予測モデルを構築済みの補酵素（PLPとFAD）に加えて、NAD類似化合物の結合予測モデルを構築した。構築した結合予測モデルの予測精度を既存の結合予測法と比較し、高い精度で結合が予測できることを確認した。また、研究代表者が開発しているWebデータベース「Het-PDB Navi」上に結合予測モデルの実行インターフェースを実装し、Web上でPLPおよびFAD、NAD類似化合物の結合予測ができるようにした。
2. PLP結合予測モデルによりPLP結合活性が予測された出芽酵母の機能未知タンパク質であるFmp41とYnl011cについて大腸菌で発現・精製を試みた。GST-Fmp41は精製でき、PLPとの結合活性を確認した。一方で、GST-Ynl011cは可溶化させることが困難であり、まだPLP結合活性を評価できていない。Fmp41については、PLPとの結合様式を明らかにするために、Fmp41-PLP複合体のX線結晶構造解析を行うこととした。そのために、Fmp41を大腸菌で過剰発現させ、アフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。この精製タンパク質を結晶化実験に使用し、複数の条件で結晶ができることを確認した。
3. Fmp41とYnl011cの細胞内代謝への関与を確認するために、栄養要求性等の変異をもたない酵母宿主を用いてFMP41とYNL011C遺伝子破壊株と過剰発現株を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 2022年度に構築を計画していたNADおよびNADP(H)の類似化合物についての結合予測モデルを予定通りに構築することができた。また、同様に2022年度に実装を計画していた、構築した結合予測モデルによる補酵素結合予測を、予定通りWebデータベースである「Het-PDB Navi」上に実装することができた。
2. 2022年度の計画通り、大腸菌で発現・精製したタンパク質を用いたPLP結合アッセイ系を確立し、出芽酵母の機能未知タンパク質であるFmp41についてはPLP結合活性を確認することができた。一方で、もう一つの出芽酵母の機能未知タンパク質であるYnl011cについてはシャペロン発現大腸菌を用いて可溶化を試みたが、改善には至らなかった。また、結合アッセイによりPLPとの結合が確認されたFmp41については、2022年度の計画にはなかったもののFmp41-PLP複合体の立体構造をX線結晶構造解析により決定し、PLPとの結合様式を明らかにすることとした。そこで、Fmp41をGSTタグ融合タンパク質として大腸菌で過剰発現させ、アフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。得られた精製タンパク質の結晶化実験を行ったところ、いくつかの条件で針状や柱状の結晶が得られた。
3. 機能未知タンパク質の細胞機能の探索のために2022年度に計画していたことのうち、代謝経路に欠損をもたない酵母宿主を用いて機能未知であるPLP結合タンパク質候補遺伝子の破壊株と過剰発現株を構築し、オミックス解析の準備を完了させた。
以上により、2022年度に計画していたことの多くが実施でき、一部は計画以上のことを実施できたため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 機能未知タンパク質が酵素活性を持つかどうかをより広範囲に推定するためには、酵素活性に必要な補因子の結合予測モデルを拡充する必要がある。そこで2023年度は、補因子として使われうる金属イオンの結合予測モデルを構築する。また、タンパク質との複合体構造情報が少ない補因子についても、転移学習などを活用することで予測モデルの構築を試みる。
2. 大腸菌で発現させたYnl011cについては可溶化が困難であったので、本来の宿主である酵母で高発現させることにより可溶化を試み、PLP結合活性を確認する。Fmp41については、PLPの結合および未結合の立体構造情報を得るために、可溶性画分に多く標的タンパク質が存在する発現条件を確立した後、アフィニティークロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、PLPとこれらの精製タンパク質との複合体構造の結晶化実験、X線結晶構造解析の実験を行う。既に、大量調製および小スケールでの結晶化条件については検討を終えている。また、PLPとこれらの精製タンパク質との結合定数を、分光光度計によるPLPの吸光度変化の測定や等温滴定カロリメーターによる結合熱の測定で決定できるか確認する。
3. FMP41とYNL011C遺伝子破壊株と過剰発現株について、RNA-seq法によるトランスクリプトーム解析とOrbitrap質量分析計によるメタボローム解析を行い、これらのタンパク質が関与する代謝経路を特定する。
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| Remarks |
構築した結合予測モデルにより、PLP、FAD、NAD類似化合物の結合を予測するインターフェースを実装した。
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