2022 Fiscal Year Annual Research Report
Innovative antibacterial drug delivery system to intracellular bacteria
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22H03956
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
新留 琢郎 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (20264210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤 智裕 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (30284756)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞内寄生菌 / 銀ナノ粒子 / ポリマーナノ粒子 / サルモネラ / 抗酸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究初年度において、マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞にサルモネラ菌を感染させ、それを細胞内に寄生させる条件検討から開始した。この際、サルモネラ菌には緑色蛍光タンパク質（GFP）を組み込んだものを使用し、感染の様子を蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで検出できるようにした。一方、銀ナノ粒子表面をカチオン性ポリマーやシリカで修飾し、また、銀ナノ粒子を内包したポリ乳酸ナノ粒子も作製した。これらの中で、銀ナノ粒子を内包したポリ乳酸ナノ粒子が生理的塩濃度の緩衝液中で高い分散安定性を示すことがわかり、今後、この粒子を使用することとした。なお、細胞内での局在がわかるようポリ乳酸ナノ粒子に赤色系蛍光色素を入れた。上記サルモネラ菌が感染したRAW細胞に銀ナノ粒子内包ポリ乳酸ナノ粒子を添加した結果、銀ナノ粒子内包ポリ乳酸ナノ粒子は細胞内に取り込まれ、細胞内に寄生しているサルモネラ菌数が減少していることを確認した。しかし、両者の詳細な細胞内局在は明らかにできなかった。
抗酸菌（Mycobacterium avium）は肺MAC症の原因菌で、慢性の肺障害を引き起こす。結核菌と同じ属に属し、サルモネラ菌とはことなる寄生メカニズムをもつ。本研究では、新たにMycobacterium aviumを細胞内寄生菌として加え、サルモネラ菌と比較すると共に、肺MAC症の治療法開拓に繋げられないかと発案した。2022年度は、Mycobacterium aviumに緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質を組み込み、細胞内寄生を簡単に観察するための準備を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
サルモネラ菌を取り扱う当初の計画に加え、Mycobacterium aviumもその対象菌として追加した。複数の寄生菌に対する効果を比較検討することで、感染菌の特性の違いを理解するのみならず、寄生菌傷害の戦略の違いも明らかにできると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
サルモネラ菌の細胞内寄生のモデルを作り、それを蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで評価できるようになった。この実験系を基礎に、さらに表面修飾のバリエーションを加え、より効率よく感染細胞に取り込まれ、細胞内寄生菌を傷害する銀ナノ粒子を見出す。その表面修飾として、細胞表面の糖鎖を認識するタンパク質や、細菌から放出される膜小胞（細胞壁の成分を含んでおり、宿主細胞表面で認識されることを期待）による修飾を施す。
一方、感染細菌と銀ナノ粒子の細胞内での共局在については、蛍光顕微鏡観察に加え、電子顕微鏡観察も試みたい。
Mycobacterium aviumについても、RAW細胞あるいはTHP-1細胞（ヒト急性単球性白血病細胞：マクロファージのモデルとしてよく利用される）への感染モデルを作製し、細胞内寄生菌に対する銀ナノ粒子の傷害活性の評価系を構築する。Mycobacterium aviumは増殖が極めて遅く、データを出すのに非常に時間がかかるので、早めに取りかかり、3年間の研究期間内に多くのデータが取れるよう、準備を進める。
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