2023 Fiscal Year Annual Research Report
Exploration of stereochemical diversity of natural products by engineering of diastereoselective enzymes
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23H02150
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
加藤 直樹 摂南大学, 農学部, 准教授 (90442946)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永野 真吾 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | Diels-Alderase / デカリン合成酵素 / デカリン / 酵素機能改変 / 糸状菌二次代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
天然物生合成経路における構造多様性創出の鍵酵素のひとつが、Diels-Alderaseと呼ばれる環化酵素群である。近年発見が相次ぐ本酵素群の中で、高いジアステレオ選択性を示す点で特徴的であるFsa2ファミリーデカリン合成酵素に焦点を絞り、酵素の構造と機能（産物の立体化学）の相関を解き明かし、酵素の合理的なデザインによる反応の立体選択性の自在改変を目指している。今年度の成果は以下の通りである。
（1）in vitroアッセイ系の拡張；in vitroアッセイ系において基質供給を担うPKS-NRPSハイブリッド遺伝子改変糸状菌の作製を行った。cisデカリン化合物の生合成経路より担当遺伝子を取得し、対応する遺伝子と置換した改変株を作製するとともに、より精密な基質供給を可能とするためのドメインスワッピング実験に着手した。また、化学合成基質による酵素機能評価を目指し、Fsa2本来の基質であるテトラエノイルテトラミン酸のジアステレオ選択的合成に取り組んだ。さらには、テトラミン酸部位の立体化学制御を目指し、フォマセチンおよびエキセチン生合成酵素Phm1、Fsa1の担当ドメインの機能解析にも着手した。
（2）新規に取得したFsa2ホモログ酵素についてAlphaFold2を用いた立体構造予測を行うとともに、これまでに取得したホモログ酵素との比較を行った。
（3）より精密な酵素・基質結合モデル構築に向け、Fsa2およびPhm7のプロダクト結合型結晶構造解析に取り組み、Fsa2について、その立体構造決定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
4つの立体化学の異なるデカリン骨格に対応する酵素の取得が完了し、その機能解析を行うための準備は順調に進展している。また、プロダクト結合型酵素の結晶構造決定に成功し、酵素機能改変に向けた、より精細な基質結合モデルの構築が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
構築する機能評価基盤を活用し、立体構造に基づく機能予測とその検証、基質結合モデルに基づいた変異酵素作製のその機能評価に研究の重点を移すことで、さらなる研究推進を図りたい。
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