2023 Fiscal Year Annual Research Report

Investigating the relationship between DNA replication timing and regulation of gene expression

Research Project

Project/Area Number	23H02178
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Kwansei Gakuin University
Principal Investigator	田中克典関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (60273926)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	川上慶島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (00722836)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2027-03-31
Keywords	DNA複製 / DNA複製タイミング / 遺伝子発現制御 / 分裂酵母
Outline of Annual Research Achievements	これまでに分裂酵母deletion libraryを用いた網羅的スクリーニングにより、DNA複製、RNA転写、核内構造などの機能を持つ遺伝子がサブテロメアのヘテロクロマチン構造維持に寄与することを明らかにしてきた。DNA複製因子にはRif1およびMrc1といった、DNA複製のタイミングを調節する因子が含まれていた。今回Mrc1に着目し、Mrc1変異株におけるヘテロクロマチンの遺伝子サイレンシングおよびクロマチンの状態をRT-PCRやクロマチン免疫沈降法を用いて解析した。その結果、Mrc1がサブテロメアヘテロクロマチンにおける遺伝子サイレングに必須の機能を持つこと、ヒストンH3K9のメチル化の維持に重要であることを見出した。H3K9me2とH3K9me3に着目してそれぞれの抗体でChIPを行ったが、結果に差はなく、Mrc1はdiメチル、triメチルに関係なくその維持に貢献することが分かった。また、Mrc1のドメイン解析を行った結果、C末端側に存在するHBSドメインがヘテロクロマチンの維持に重要な機能を持つことを明らかにした。Mrc1変異株において、ヘテロクロマチンにおけるヒストンH3K9のメチル化が低下し、ヒストンH3K14のアセチル化レベルが上昇することを見出した。ヒストンH3K14の脱アセチル化酵素であるMst2とMrc1の二重変異株を作製して解析した結果、H3K9meレベルが野生株と同程度に回復した。これらのことから、Mrc1がH3K14のアセチル化を抑制することで、ヘテロクロマチンの維持に貢献することを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 一部、当初の計画通りに進んでいない計画もある。ただ、それはヘテロクロマチンの維持におけるMrc1のの役割に関して、新たな進展が得られたためである。よって、研究全体としては概ね順調であると判断した。
Strategy for Future Research Activity	次年度は以下の点に着目し、研究を行う (1) 脱アセチル化酵素Clr3を含むSHREC複合体とMrc1の関係性を解析する。(1-1)Mrc1変異体におけるSHREC構成サブユニットのヘテロクロマチン局在量を定量する。(1-2)SHREC構成サブユニットとMrc1の遺伝学的相互作用を解析する。二重変異体を作製し、ヘテロクロマチンのサイレンシングの状態を解析する。(1-3) Mrc1とSHRECとの物理的相互作用を解析する。 (2)ヘテロクロマチン制御におけるMrc1のphosphodegron配列の関与を検証する。 Mrc1のHBSドメインは複製のタイミングを制御するドメインであり、ヘテロクロマチンのサイレンシングに関与するが、HBSドメインの中にリン酸化依存的に分解が誘導されるphosphodegron配列が存在する。HBSを欠損させた結果、Mrc1のタンパク質が安定化することが分かっている。そのため、ヘテロクロマチン制御におけるMrc1のHBSドメインに含まれるphosphodegron配列の関与を検証する。