Functional analyses of bacterial cspC/E genes found in barley genome

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23H02354
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 今井 亮三 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, エグゼクティブリサーチャー (90291913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 健太郎 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (40399423)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 低温ショックタンパク質 / オオムギ / 進化 / RNAシャペロン / 共生

Outline of Annual Research Achievements

１) RNAシャペロン機能の証明
HvCSD1-3に，細菌CSPとしての機能があることを証明する．大腸菌の CSP四重変異株BX04（cspA, cspB, cspE, cspG）は10℃で生育できないが，いずれかのCsp遺伝子の発現により相捕される．そこでBX04株に，HvCSD1-3の各遺伝子を導入して，相補性によりCSPとしての機能を検討した。HvCSD1-3遺伝子を導入したBX04株は15℃での生育不全を部分的に回復することが示された。しかし大腸菌由来のCspAに比べるとその機能回復は弱いため、RNAシャペロンとしての活性は弱いものと考えられた。
２) HｖCSD1-3の発現解析
オオムギ品種「スノーファイバー」ゲノムにはCSD1及び CSD3が検出される。そこでこれらの遺伝子の発現を低温ストレス環境下で調べた。RT-PCR及びリアルタイムPCRを用いて検討したところ、両遺伝子とも24時間までの低温ストレスにより誘導されることがわかった。低温耐性獲得に関連した機能を有することが推定された。
３) HvCSD1-3の機能破壊・過剰発現株の作出
HvCSD1-3の機能を解明するため，オオムギ品種「ファイバースノー」,「ニシノホシ」を材料に、HvCSD遺伝子変異体作出を行った。各遺伝子を切断するように設計されたゲノム編集酵素（CRISPR/Cas9 RNP）を茎頂組織にiPB法を用いて導入した。変異体の解析は導入当代で行い、これまでに２株の変異個体を獲得している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

RNAシャペロン機能の証明については、弱いながらもRNAシャペロン活性を持つことを示すことができた。 HｖCSD1-3の発現解析については、低温に関しては誘導性を確認することができた。他のストレスについては順次行っていく予定である。HvCSD1-3の機能破壊・過剰発現株の作出については、ゲノム編集を使った変異体の作出が順調に進行している。一方、麦類CSD遺伝子の普遍性の検討についてはまだ着手できていないため、次年度での検討事項とした。

Strategy for Future Research Activity

次年度は現在進行中の研究をスピードアップして進める。また、新たに病害耐性や共生機構との関わりを解明していく。