2023 Fiscal Year Annual Research Report

二本鎖切断を伴わないノックインアデノベクターによる新規遺伝子治療モデルの開発

Research Project

Project/Area Number	23H02402
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	中西友子順天堂大学, 医学部, 准教授 (10344863)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	古川洋一東京大学, 医科学研究所, 教授 (20272560)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2027-03-31
Keywords	アデノウイルスベクター / セーフハーバー領域 / フェニルケトン尿症 / ノックイン / CSIRPR/Cas9 / 遺伝子治療 / Rosa26
Outline of Annual Research Achievements	ゲノム編集による遺伝子治療技術は、遺伝病などの難治性疾患の根治につながる革新的な技術として期待されている。しかし遺伝病は点変異が原因であることが多く、点変異は患者や家系ごとに異なるため、点変異の修復では家系の数だけベクターが必要となる。点変異修復ではなく正常タンパク質の発現ユニットをゲノムにノックインできれば、「１遺伝病１ベクター」が実現するが、技術的に難しい。そこで、アデノウイルスベクター（AdV）の搭載容量が最大8kbであることを利用し、変異部位はそのままで、治療用遺伝子発現ユニットをセーフハーバー領域に組込んで安全に治療できる「発現ユニットノックインベクター」システムの構築を目指している。今年度は、フェニルケトン尿症マウスの治療モデル確立に向けて、正常な Pah cDNAの発現ユニットとそれを挟む左右の1.7 kb および 1.9 kb のアーム配列、およびノックイン細胞のin vivo濃縮を可能とするCypor shRNA発現ユニットからなる6kb超のドナーDNAを持ち、マウスセーフハーバー領域Rosa26を標的とするガイドRNAを発現するAdVを構築した。またノックインが起きたことが容易に確認可能となるコントロールベクターとして、Pahの代わりにGFPを挿入したAdVも同時に構築した。このAdVをCas9発現AdVとともにHepa1-6マウス細胞に感染させたところ、ドナーDNAの発現ユニット部分が2.5kb超であるにも関わらず最大7%のノックイン効率を得られ、shRNAの標的であるCypor mRNA は10%以下に減少した。このベクターはcDNAを取り替えるだけで様々な先天性代謝異常症を標的としたノックイン治療ベクター構築に応用できると考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マウスRosa26領域に遺伝子発現ユニットをノックインできるアデノベクターを作製し、in vitro実験で最大7％でノックインが起きる系を構築することができた。多くの代謝異常疾患では治療に必要な酵素量が正常の数％であること、発現ユニットノックインでは本来のプロモーターの約20倍強力なプロモーターが使えること、またノックイン細胞の濃縮が可能であることから、in vivo実験においても遺伝子の発現補填が十分可能だと考えている。
Strategy for Future Research Activity	GFP発現ユニットをRosa26にノックインできるドナーDNA搭載アデノベクターは、Cas9発現アデノベクターと共にC57BL/6に接種してin vivoノックイン効率を解析するとともに、アセトアミノフェン投与によりCypor shRNA発現抑制がおきるGFP陽性ノックイン細胞が選択的に増えることを確認する。In vivoノックイン系構築後は、フェニルケトン尿症マウスに原因遺伝子Pahの発現ユニットをノックインできるアデノベクターを接種し、高フェニルアラニン血症の改善について解析を行う。また、Rosa26だけでなくヒトセーフハーバー領域であるAAVS1を標的として遺伝子発現ユニットをノックインできるアデノベクターを構築し、ヒトでの治療も視野に入れたシステムの構築を進める。